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分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
分子克隆及DNA重组分子的转化和筛选摘要：利用限制性内切酶切割DNA及利用DNA连接酶构建重组体DNA。
通过酶切图谱比较判别重组体DNA和载体DNA。
利用氯化钙法制备大肠杆菌受态细胞和外源重组体DNA 转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体细胞技术，从而达到DNA分子重组以及重组分子的转化和筛选效果。
关键词：DNA、RNA、重组体、酶切、转化、筛选分子克隆是指分离一个已知DNA序列，并以in vivo（活体内）方式获得许多复制品的过程。
这一复制过程经常被用于增加并获取DNA片段中的基因，但也可用来增加某些任意的DNA序列，如启动子、非编码序列、化学合成的寡核苷酸或是随机的DNA片断。
体外连接的重组DNA分子导入合适的受体细胞才能进行大量复制，增殖和表达，其首要目的是获得大量的克隆基因。
虽然PCR技术，体外转录及翻译系统能部分达到大量扩增的目的，但毕竟受到体外操作的许多限制。
重组质粒导入宿主细胞最常用的方法之一就是转化（transformation）。
转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。
很多细菌如杆菌，链霉菌属能自然发生转化，其它菌属包括大肠杆菌自然状态下无法发生转化，但可以通过人工诱导使其处在易于接受外源DNA分子的状态即感受态（competence），从而使转化得以高效率地进行。
大肠杆菌的转化简便易行，它在分子克隆中占据极为重要的地位。
重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内，这项技术始于Mandel 和Higa 1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2 溶液处理短暂热休克后，容易被噬菌体感染，随后Cohn 于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘付于细胞表面，经42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收复合物。
分子克隆目录（一）.基本概念 (2)1.分子克隆： (2)2. Dalton，bp，nt (2)3.保护碱基 (2)4.T-A克隆： (2)5.RNA酶H活性： (2)6.载体： (2)7.质粒(plasmid) (2)8. F因子 (3)9. 位点偏爱（Site preference） (3)10.星星活性： (3)（二）分子克隆的基本过程 (3)1.概述 (3)2.分子克隆中常用工具酶 (3)3.基因克隆常用载体 (7)4.目的基因的分离与制备 (11)5.目的基因的体外重组 (11)6.重组子导入宿主细胞 (12)7.阳性重组子的筛选和鉴定 (13)（三）.单链丝状噬菌体 (14)1.M13 噬菌体的生物学 (14)2. M13 噬菌体载体 (17)3. M13 噬菌体载体的宿主菌 (18)4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 (17)5. 噬菌粒 (11)6. M13KO7 辅助噬菌体 (12)（一）.基本概念1.分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。
2. Dalton，bp，nt道尔顿（Dalton，Dal，Da，D）：分子量的单位，蛋白质是大分子，所以常用kDa（千道尔顿）来表示。
碱基对（bp）＝base pair，1 kb就是1000个碱基对；nt＝核苷酸nucleotide 。
3.保护碱基在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
4.T-A克隆：利用Taq酶在PCR产物3‘末端有加上一个A的特性，使得Taq酶的PCR 产物或经过Taq酶加A的PCR产物，和一个人工加上一个3’末端具有1个T的载体进行连接，由于突出末端可以互补，这样可以大大提高目的基因和载体的连接效率。
分子克隆技术课程教学大纲课程名称：分子克隆技术（Molecular Cloning Technology）课程编号：1313080216课程类别：专业课总学时数：30 课内实验时数：30学分：1开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子克隆技术是生物技术专业的专业必修课，是在分子生物学和基因操作原理等理论课的基础上开设的一门以实验为主的课程，它的任务是全面训练学生掌握分子克隆的常用技术。
本课程要求学生在掌握相关原理的基础上，通过利用质粒载体克隆拟南芥DNA片段、转化及PCR鉴定等综合性实验，学习、训练分子克隆技术的基本操作方法及操作技巧，掌握DNA重组及重组子的筛选和鉴定技术、RNA的操作、Southern杂交技术等，培养学生设计实验、观察实验现象、分析问题和解决问题的能力。
二、本课程与其它课程的联系与分工生物化学、分子生物学、基因工程原理是其先修课程。
三、课程内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”实验一PCR产物的T载体克隆一、PCR引物设计二、基因克隆三、PCR产物回收四、PCR产物与载体连接五、蓝白斑筛选PCR引物设计原则[3]；T载体的特点[3]；T载体克隆PCR产物的方法[3]；PCR产物的回收[2]；蓝白斑筛选原理[3]实验二植物目的基因的转化一、农杆菌单菌落的分离与保存二、农杆菌的活化三、Forial Dipl法转化拟南芥农杆菌单菌落的分离与保存[3]；根瘤农杆菌的生物学特性[2]；Forial Dipl法转化拟南芥原理与方法[3]实验三转基因植物的检测技术一、植物基因组DNA提取二、转基因植物在含抗生素筛选培养基中的筛选三、转基因植物的PCR检测植物基因组DNA提取原理与方法[3]；引物的设计与合成[2]；反应体系[3]；循环参数[3]；扩增产物的检测[3]四、实验方式与要求1．实验前学生必须进行预习后，方可进入实验室进行实验。
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）一、名词解析二、填空题1.基因工程中有三种主要类型的载体、和。
2.就克隆一个基因来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分和、。
另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。
3.如果两个质粒不能稳定的存在已同一个宿主细胞中，则属于群，这是因为他们的所致。
4.pBR 322是一种改造型质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来源于，它的氨苄青霉素抗性基因来源于。
5.Puc18质粒是目前使用较为广泛的载体。
pUC系列的载体是通过和两种质粒改造而来。
它的复制子来源于，Amp抗性基因则是来源于。
6.当λ噬菌体DNA进入宿主细胞以后是靠宿主细胞的和形成封闭的环状的DNA分子的。
7.λ噬菌体是感染大肠杆菌的噬菌体。
8.α-互补是指 lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的阴性的突变体之间实现互补。
9.溶源化的频率和与有关。
10.噬菌体DNA通过其上唯一的整合位点与宿主染色体DNA上的唯一整合位点发生重组，从而整合到染色体中。
11.通过分析大量缺陷型λ噬菌体的 DNA ，发现 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被或替换后，不影响λ噬菌体裂解生长。
12.对野生型大肠杆菌来说，向溶源和裂解方向的转变是由和决定的。
13.代表性λ噬菌体载体有和14.粘粒的组成包括________，________，________。
15.柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由________和_______cos尾巴构建的复合载体。
16.pcos1 EMBL 是设计用于筛选体内重组的重组粘粒文库，通过同源重组过程达到筛选目标克隆的目的。
该载体的复制起点来源于__________质粒，含_________和_________抗性基因。
17.酵母人工染色体由酵母染色体的__________、__________和__________等功能性DNA序列组成。
