反相色谱柱的清洗和再生方法

液相色谱清洗流程：（反相系统）
流动相：1:准备80度左右的热水，加30%左右的异丙醇，2：3% 的双氧水3:10%的硝酸。

4，纯水。

用两通代替色谱柱，流量3ml/min，把四个通道滤头全部放入准备好的流动相。

各通道25%比例。

打开排空阀，流动相冲洗5分钟。

关闭排空阀，取此流动相为样品。

进样100微升，运行10针。

每针1分钟。

（依次使用上述4种流动相处理）
更换样品瓶玻璃滤头，和排空阀过滤白头、
装上柱子，用10%水和纯乙腈或者甲醇，分别冲洗柱10分钟流量1ml/min。

再用分析方法的流动相平衡柱20-30 分钟。

液相柱反冲流程
将色谱柱出口接到进口管线上，用混合流动相，水，甲醇，乙腈等，或者反复梯度：例：
0分钟10%甲醇90%水。

120分钟100%甲醇。

240 分钟10 %甲醇。

360分钟100 %甲醇…….。

流量0.1-0.2ml/min。

柱原来的进口端侵泡在有混合液体的烧杯内。

以保证流出污染物溶解
分散。

正相、反相和极性胶联柱使用手册分类:质量检验 2007.3.22 22:20 作者：LAI | 评论：0 | 阅读：146正相、反相和极性胶联柱使用手册Chrompack HPLC Normal-,Reversed phase and Polar bonded columns 注意:此色谱柱填充的是改性硅胶材料。

向柱内导入碱性溶剂（pH>7.0）或酸性溶剂（pH<2.0）会导致柱子损坏。

在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。

未正确地使用不能享受保修待遇。

1．简介此柱填充的是反相或者极性胶联型态的硅胶基质材料的硅胶。

硅胶形态的柱子用于正相（非水）条件。

反相（C8，C18，ODS，RP-8和RP-18）通常用于反相条件（水相）。

极性胶联型（APS，diol，CN和NH2）依照应用目的，可以用于正相和反相条件。

建议不要将一个相同的柱子用于差别非常大的条件下，这是因为柱子在特定的条件下，固定相的性质会发生变化，所以在其他的条件下，会影响柱效。

也不建议将硅胶柱用在反相条件下或者将方向柱用在正相条件下，这是因为这种过程会发生重复性差的问题（每一次注射之间和柱与柱之间的比较）。

2．色谱柱老化在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。

一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。

A．在反相条件下老化要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。

在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。

因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。

如果流动相中使用了添加物（例如缓冲液或离子对试剂），建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。

缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用正常流速。

B．在正相条件下老化柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。

柱子的干燥（激活）或润湿（失活）可能是需要的。

使用的溶剂可能是水饱和的或者是无水的。

干燥柱子可以使用无水的二氯甲烷。

液相色谱柱的保存液相色谱维护和修理保养1.反相色谱柱每天试验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，试验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。

注意：不能用纯水冲洗柱子，应当在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。

2.长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必需存于合适的溶剂下。

对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。

储存的温度好是室温。

液相色谱柱的使用和维护在液相色谱操作过程中，我们需要下面的问题，便利维护液相色谱柱。

A柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。

必需防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。

B.假如仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。

C.避开压力和温度的急剧变化及任何机械震动。

温度的蓦地变化或者使液相色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充情形；柱压的蓦地上升或降低也会冲动柱内填料，因此在调整流速时应当缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。

D.应渐渐更改溶剂的构成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂更改为全部是水，反之亦然。

E.如使用柱温掌控装置时，应注意在通人流动相后才能升温。

F.一般说来液相色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。

否则反冲会快速降低柱效。

G.选择使用适合的流动相，以避开固定相被破坏。

有时可以在进样器前面连接一个预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避开分析柱中的硅胶基质被溶解。

H.避开将基质多而杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。

保护柱一般是填有相像固定相的短柱。

保护柱可以而且应当常常更换。

反相HPLC色谱柱的推荐再生步骤是什么？1. 取下色谱柱，然后重新连接到色谱仪上，让液体/气体反方向流过色谱柱。

2. 用HPLC 级水冲洗掉盐/缓冲液。

以1毫升/分钟的速度把25 毫升水泵入色谱柱。

3. 用25 毫升异丙醇冲洗色谱柱。

4. 用25 毫升二氯甲烷冲洗色谱柱。

5. 用25 毫升正己烷冲洗色谱柱。

6. 再次用25毫升二氯甲烷冲洗色谱柱。

7. 用25毫升异丙醇冲洗色谱柱。

8. 按正确的流动方向，把色谱柱重新连接到色谱上。

用不含缓冲液的流动相冲洗色谱柱，然后重新倒入缓冲液。

9. 用25 到50 毫升流动相平衡色谱柱。

10. 注入标准物或样品，检查性能是否恢复。

色谱柱的保养在正常情况下，色谱柱至少可以使用3—6个月，能完成数百次以上的分离。

但是，若操作不慎，将使色谱柱很易损坏而不能使用。

因此为了保持柱效、柱容量及渗透性，必须对色谱柱进行仔细地保养。

1．色谱柱极易被微小的颗粒杂质培塞，使操作压力速升高而无法使用，因此必须将流动相仔细地蒸馏或用0.45μm孔径的滤膜过滤。

在流动相组贮槽与色谱柱间，安装0.45μm 孔径的过滤器。

在柱子上端接头处装上多孔过滤片，以防止固体颗粒进入色谱柱中。

在水溶液流动相中，细菌容易生长，可能堵塞筛板加入0.01％NoHa能防止能防止细菌生长。

2．最好使用进祥阀进样，以防止注射器进样时、注射隔膜碎屑堵塞柱子入口。

3．对硅胶基键合相填科，水溶液流动相的PH值不得超出2—8．5的范围，使温度不宜过高。

柱子在酸性或碱性条件下使用之后，。

应依次用水、甲醇清洗，对暂时不用而需要较长时间保存的柱子，要用纯甲清洗，柱子两端用金属螺帽封闭，保存于干净的有机溶剂中。

4．要防止色谱柱被振动或撞击，否则柱内填料床层产生裂缝和空隙，会使色谱峰出现“驼峰”或“对峰”。

5．要防止流动相逆向流动，否则将使固定相层位移，柱效下降。

6．使用保护柱。

连续注射含有未被洗脱样品时，会使柱效下降，保留值改变。

色谱柱冲洗方法（最新版4篇）篇1 目录1.色谱柱冲洗的必要性2.色谱柱冲洗的方法2.1 水冲洗法2.2 有机溶剂冲洗法2.3 缓冲盐冲洗法2.4 反冲法3.色谱柱冲洗的注意事项篇1正文色谱柱是液相色谱系统中的核心部件，它在样品分离过程中起着至关重要的作用。

然而，在色谱柱使用过程中，柱内可能会积累一些脏物或盐析物，影响色谱柱的分离效果。

因此，对色谱柱进行定期冲洗是非常必要的。

下面我们将介绍几种常见的色谱柱冲洗方法。

首先，水冲洗法是最常用的色谱柱冲洗方法。

此方法操作简便，只需将色谱柱连接到水流系统上，使用纯水进行冲洗。

篇2 目录一、色谱柱冲洗的必要性二、色谱柱冲洗的方法1.水冲洗法2.纯有机相冲洗法3.缓冲盐冲洗法4.反冲法5.专用清洗剂冲洗法三、不同类型色谱柱的冲洗方法1.反相色谱柱2.正相色谱柱3.离子交换色谱柱4.凝胶渗透色谱柱四、色谱柱冲洗的注意事项篇2正文色谱柱是高效液相色谱系统中的核心部件，其在样品分离过程中起到关键作用。

然而，在长时间的使用过程中，色谱柱内部可能会积累一些脏物，影响色谱柱的分离效果。

因此，对色谱柱进行定期冲洗是非常必要的。

色谱柱冲洗的方法有很多种，下面我们分别进行介绍：1.水冲洗法：这是一种最常用的色谱柱冲洗方法。

使用纯水或含有少量缓冲盐的水进行冲洗，可以有效去除色谱柱内部的脏物。

对于反相色谱柱，可以使用纯水或甲醇/水混合溶液进行冲洗。

2.纯有机相冲洗法：在冲洗色谱柱时，可以使用纯有机溶剂（如乙腈、甲醇等）来代替水相。

这种方法适用于具有疏水性的色谱柱，如 C18、C8 等。

3.缓冲盐冲洗法：在冲洗过程中，可以加入一定浓度的缓冲盐，以保持色谱柱内部的离子强度。

这种方法适用于离子交换色谱柱和凝胶渗透色谱柱。

4.反冲法：这是一种比较彻底的冲洗方法，可以有效去除色谱柱内部的沉淀物。

在反冲过程中，需要将色谱柱的流动相改为反向，并提高流速。

然而，反冲过程可能会对色谱柱造成一定程度的损伤，因此需要谨慎操作。

反相色谱柱的清洗和再生方法2010-11-5 18:13:23反相色谱柱的清洗和再生方法反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。

大多数用于反相色谱的固定相本质上都是疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小程度来分离的，样品基体中其它疏水杂质组分也能以同样的方式保留。

除C18、C8、C4、C2、C1、CN、NH2和Phenyl等常见的一些键合硅胶固定相外，还有几个分支品种，如混合相固定相（例如苯基－己基）、封尾和未封尾的填料种类以及极性嵌入固定相等。

还有其它很多填料也用于反相色谱，包括聚合物、聚合物包覆硅胶和聚合物包覆氧化铝、无机－有机杂化物、涂覆氧化锆和石墨化碳等。

不同的固定相分别都有自己的优点和缺点。

反相色谱柱通过调节流动相组成的变化和添加一些试剂的方式，成功实现了许许多多不同的色谱应用。

一些技术是利用添加剂改变了填料的表面特性，有时候这些添加剂本身有可能会污染硅胶和键合相表面。

硅胶表面除了有疏水键合相外，还有别的一些化学特性。

残留的硅醇基存在于所有的硅胶键合填料中。

这些硅醇基具有弱酸性，因此能与某些待分析物和样品基体中的杂质相互作用，特别是与碱性物质发生作用。

因为硅醇基的pKa值大约是4.5，离子化能在中性pH条件下发生，而存在与阳离子产生静电相互作用的可能。

较老的A型硅胶含有高浓度金属杂质离子（有时候达100ppm或更多），而这能使硅胶表面的酸性更大，甚至能与某些金属鳌合化合物发生作用。

残留硅醇基在非末封尾的键合硅胶表面和在C2或C4等短链硅胶键合相填料中，麻烦更大。

必须清楚地了解所用固定相的表面特性和可能存在的分析物－固定相表面的相互作用模式，这样当用反相色谱方法时才能充分考虑到潜在的样品基质污染的影响。

例如，疏水性非常强的样品基质如玉米油、高芳香物质和蜡能粘在反相填料的表面并且改变表面性质。

1、色谱柱的使用说明：（1）色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。

在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。

在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。

（2）流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。

如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。

另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。

以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。

当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。

（3）样品：样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。

在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。

2、色谱柱的保存（1）反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。

注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。

（2）长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。

对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。

储存的温度最好是室温。

3、色谱柱的再生因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。

反相系列色谱柱(RPC)使用说明书1. 适用范围以硅胶为基质，表面键合C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C1(SAS)、C6H5(Phenyl)官能团的反相色谱（RPC, Reversed Phase Chromatography ）填料的系列色谱柱。

2.性能验收收到色谱柱，开箱检验确认后，请尽快按照色谱柱评价报告中的色谱条件进行测试，以确认色谱柱品质。

样品：① 尿嘧啶(5.0×10-6g/mL) ② 苯乙酮(2.0×10-5g/mL) ③ 甲苯(7.5×10-4g/mL) ④ 乙苯(6.0×10-4g/mL) ⑤ 芴(1.0×10-5g/mL)样品均使用流动相溶解及稀释。

注：如上述条件与色谱柱检测报告不一致，以检测报告为准。

3.色谱柱连接色谱柱入口和出口按色谱柱标签箭头所示方向连接。

色谱柱连接管端口部分必须平整，不能出现毛刺和切口斜面等现象。

在可能的条件下，色谱柱两端的连接管路要尽可能短，连接管内径应尽可能小，以防止因样品扩散造成不能反映色谱柱真实柱效等情况发生。

4. 使用pH 值范围和耐水性常规色谱柱使用pH 值范围是2.0~8.0，特殊填料色谱柱pH 值使用范围更宽，如Supersil 系列为1.5~10，SinoPak 系列为1~12。

常规色谱柱是使用水相不高于90%，特殊处理的填料色谱柱耐水性更高，如SinoChrom ODS-BP 色谱柱最高使用水相比例可达95%，AQ 系列色谱柱可以使用100%水相。

5.使用温度范围推荐使用温度不高于60℃。

当使用磷酸盐缓冲液，在中等或高pH 值操作时，建议柱温不要超过40℃。

使用中避免温度突然升高。

6.色谱柱储存过夜或短时间储存：使用缓冲溶液或含盐流动相时，需要用10%~20%甲醇/水或乙腈/水将色谱柱和系统内流动相置换，色谱柱储存溶剂中有机溶剂浓度不低于20%。

长时间储存：可以用纯甲醇或纯乙腈储存，并将色谱柱堵头拧紧。

如何清洗和保存反相色谱柱？如何清洗和保存反相色谱柱？怎样处理新买来的色谱柱？用水来冲洗色谱柱有什么后果？分析结束后如何冲洗？这些问题是HPLC分析人员常常面对的。

本文就这些问题介绍一些色谱柱的维护和保养经验。

新色谱柱的处理对于新购买的色谱柱，首先应该做些什么呢？几乎所有的色谱柱在出厂时都保存在它们测试时的溶剂中，通常是60-80%的甲醇/水，这与在反相色谱中使用的流动相是兼容的，所以可以直接转换到所要使用的流动相。

另外，也可以先用20-30ml流动相中的强溶剂甲醇、乙腈或者四氢呋喃冲洗色谱柱，然后再转换到所需流动相。

需注意的是，在冲洗或平衡色谱柱时，重要的是溶剂的体积而不是冲洗时间。

提高流速可以缩短冲洗平衡时间。

如果使用有机溶剂和水或缓冲溶液，10倍柱体积的流动相可以使色谱柱达到冲洗平衡。

如果流动相使用离子对试剂，则需20-50倍柱体积的流动相。

对于直径4.6mm的色谱柱，其柱体积可以按下式估算：Vm=0.1L其中，Vm为柱体积（ml），L为色谱柱的长度（cm）。

故一个15cm x 4.6mm色谱柱大概的柱体积为1.5ml。

直径2.1mm的色谱柱的柱体积大约为4.6mm的20%，所以5cm x 2.1mm 的色谱柱含溶剂为100uL。

对于B型高纯硅胶基质填料的色谱柱，色谱柱的再现性很规范，这与15年前普遍使用的、不是很纯的A型硅胶基质填料的色谱柱形成鲜明对比，但很多用来分析产品和原料的“流传”下来的HPLC方法仍沿用这种色谱柱。

有的时候，新的色谱柱需要运行几针分析样品才能使保留时间和峰面积保持稳定。

这种情况对于新型的色谱柱比较好一些，但仍需一段时间的磨合。

有时可以通过运行高浓度的样品或对照品来加速最初的色谱柱平衡。

例如，如果你看到运行了几针50ng的对照品，其保留时间和峰面积有所飘移，试一试运行1ug的对照品。

这种方法常常可以加速柱平衡的时间。

用水冲洗色谱柱我们常常会被问到这样一些问题：“我的样品是水溶性的，流动相中含有缓冲盐和甲醇，我不能用水来冲洗所有水溶性的污染物吗？”回答是：“不可以”。

清洗受污染的色谱柱，为何要用异丙醇？已有4人参与
前些时候，回帖建议虫友用异丙醇冲洗反相色谱柱。

斑竹问我，为何要用异丙醇。

咳咳，平时不求甚解，所以一下子也答不上原因。

后来查了些资料，分享一下：
首先，异丙醇特殊的溶解性，异丙醇能和乙酸、丙酮、乙腈、苯、丁醇、四氯化碳、氯仿、环己烷、二氯甲烷、DMF、DMSO、乙酸乙酯、乙醇、二乙醚、正己烷、甲醇、THF、甲苯、水、二甲苯等液相可能用到的几乎所有的溶剂混溶。

混溶比例，不深究。

其次，使用流动相时，若溶剂的混溶性不好甚至不混溶，会形成乳化的小液滴，毁坏色谱柱。

由此可得知，异丙醇具有某些特点：“去污能力”强；不伤色谱柱。

以它作为过渡溶剂和清洗受污染的色谱柱及液相配件，情理之中了。

注：异丙醇粘度大，会使压力上升。

另附被污染的正相、反相色谱柱的清洗方法。

反相色谱柱（C18、C8）：
水/乙腈95/5
→100%乙腈
→乙腈/异丙醇75/25
→100%异丙醇
→100%二氯甲烷
→100%己烷
（若需用到二氯甲烷、己烷，使用反相流动相前需用异丙醇过渡）（根据污染物性质，选择合适的冲洗溶剂及程序）
正相色谱柱（SiO2、Diol）：
甲醇/三氯甲烷50/50→100%乙酸乙酯
还请各位多多交流，指点。

在用的最多的就是反相C18色谱柱,在平时的工作中,个人积累了一些小经验,很管用的，在此与大家分享1、新柱的处理：我们每次新买的柱子虽然是经厂家测试过并密封好的，可是有的柱子到达手中时已经过很长的时间了，因此，我们每拿到一根新的色谱柱都必须要对柱子进行处理。

首先，是配制好65%的乙腈/水，再把色谱柱正确的连接在色谱仪上，出口放空（注意：出口端切不可连上检测器，以免污染了检测器），以低流速0.1ml/min~0.5ml/min（如果是LC/MC 柱子，则应以0.3ml/min进行）均可，不可以高流速进行，等看见柱子出口有液体流出后，过20分钟后再接上检测器，以循序渐进的方法将流速调至1.0ml/min（如果是LC/MC柱子则应以0.3ml/min进行），继续冲洗2~8小时。

2、新柱的使用：首先我们确认所分析样品流动相的PH是不是在色谱柱PH的耐受范围之内，以免损伤柱子!如果，确认在柱子的使用范围之内，就用做样品的流动相平衡柱子(如果流动相中含用缓冲盐溶液，在平衡柱子之前务必要先用5%甲醇或5%乙腈去过渡30分钟以上。

再用带盐的流动相去平衡色谱柱。

)当色谱柱平衡了足够时间，基线非常平稳的时候，方可进样分析。

不管是分析什么样的产品，由于各种各样的因素，样品中总有杂质。

因此，最好在色谱柱前端加上保护柱。

以增加色谱柱的使用寿命！3、色谱柱清洗：①如果样品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流动相，在做完样品之后可直接用55%~65%乙腈/水或者用55%~65%甲醇/水冲洗色谱柱40~80分钟，然后以纯甲醇或乙腈冲洗30分钟，即可保存；②如果样品分中流动相里含用缓冲液或酸或离子对试剂的流动相，在做完样品之后的清洗必须按照如下步骤进行清洗柱子:先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水，以1ml/min,冲洗1.5小时以上(如果色谱柱更长，则还需要增加适当时间);然后用55%甲醇/~水65%/水冲洗色谱柱30~60分钟.最后用甲醇或乙腈以1ml/min冲洗30分钟。

如何清洗和保存反相色谱柱？如何清洗和保存反相色谱柱？怎样处理新买来的色谱柱？用水来冲洗色谱柱有什么后果？分析结束后如何冲洗？这些问题是HPLC分析人员常常面对的。

本文就这些问题介绍一些色谱柱的维护和保养经验。

新色谱柱的处理对于新购买的色谱柱，首先应该做些什么呢？几乎所有的色谱柱在出厂时都保存在它们测试时的溶剂中，通常是60-80%的甲醇/水，这与在反相色谱中使用的流动相是兼容的，所以可以直接转换到所要使用的流动相。

另外，也可以先用20-30ml流动相中的强溶剂甲醇、乙腈或者四氢呋喃冲洗色谱柱，然后再转换到所需流动相。

需注意的是，在冲洗或平衡色谱柱时，重要的是溶剂的体积而不是冲洗时间。

提高流速可以缩短冲洗平衡时间。

如果使用有机溶剂和水或缓冲溶液，10倍柱体积的流动相可以使色谱柱达到冲洗平衡。

如果流动相使用离子对试剂，则需20-50倍柱体积的流动相。

对于直径4.6mm的色谱柱，其柱体积可以按下式估算：Vm=0.1L其中，Vm为柱体积（ml），L为色谱柱的长度（cm）。

故一个15cm x 4.6mm色谱柱大概的柱体积为1.5ml。

直径2.1mm的色谱柱的柱体积大约为4.6mm的20%，所以5cm x 2.1mm 的色谱柱含溶剂为100uL。

对于B型高纯硅胶基质填料的色谱柱，色谱柱的再现性很规范，这与15年前普遍使用的、不是很纯的A型硅胶基质填料的色谱柱形成鲜明对比，但很多用来分析产品和原料的“流传”下来的HPLC方法仍沿用这种色谱柱。

有的时候，新的色谱柱需要运行几针分析样品才能使保留时间和峰面积保持稳定。

这种情况对于新型的色谱柱比较好一些，但仍需一段时间的磨合。

有时可以通过运行高浓度的样品或对照品来加速最初的色谱柱平衡。

例如，如果你看到运行了几针50ng的对照品，其保留时间和峰面积有所飘移，试一试运行1ug的对照品。

这种方法常常可以加速柱平衡的时间。

用水冲洗色谱柱我们常常会被问到这样一些问题：“我的样品是水溶性的，流动相中含有缓冲盐和甲醇，我不能用水来冲洗所有水溶性的污染物吗？”回答是：“不可以”。

色谱柱的维护与保养一、C8及C18反相色谱柱（新的色谱柱）应该在自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。

使用前应该用小流速的和色谱柱内部相同的溶剂冲洗一定的时间。

具体步骤如下：（1）准备新鲜超纯水及色谱级乙腈或甲醇，冲洗色谱仪器系统，保证仪器系统管路干净。

（新柱老化前，此步决不可忽略）（2）将色谱柱反向连接，不接检测器。

用水-有机相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗20～30min。

（目的是冲洗出柱入口端无机杂物与筛板孔杂物，使筛板正常）（3）再将色谱柱正向连接，不接检测器。

用水-有机相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗20～30min。

（目的是冲洗出柱出口端无机杂物与筛板孔杂物，使筛板正常）（4）连接检测器，开启柱温达30℃～40℃，用水-有机相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗4h以上。

（目的是充饱和色谱柱，去除柱内空气）（5）用水-有机相（10：90～5:95），以0.3～0.6ml/min流速冲洗2h以上[或在120min内以水-有机相（95:5→0:100）梯度变化，以0.3～0.6ml/min流速冲洗]→再用100%有机溶剂，以0.3～0.6ml/min流速冲洗1h以上→最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上。

（目的是老化色谱柱）（6）在平衡前根据水相-有机相的比例，首先调整水-有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30左右（目的是相平衡过渡）。

如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡，必需先用90%以上水进行预平衡30min以上，否则，会导致缓冲盐在柱内析出结晶，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。

（7）然后更换成新制并经0.45um滤膜过滤，超声脱气后的流动相，按检测方法平衡至少1h，待基线稳定后，开始进样检测。

反相色谱柱的使用步骤说明反相色谱柱是一种广泛应用于分离和纯化化合物的色谱柱。

它的基本原理是利用柱填料上的非极性部分与待分离化合物进行相互作用，以实现不同化合物之间的分离。

在使用反相色谱柱之前，需要进行柱的准备和条件的选择。

下面是使用反相色谱柱的详细步骤说明。

步骤1：柱的准备首先，将新的反相色谱柱安装在色谱仪上。

要确保柱的安装正确，并与仪器的连接稳固。

步骤2：溶剂的准备选择合适的溶剂体系。

通常情况下，反相色谱柱的常用溶剂体系是水-有机溶剂体系，一般为水-甲醇或水-乙腈。

根据待分析样品的性质和需要，可以调整水和有机溶剂的比例以及其他添加剂。

步骤3：样品的准备将待分析样品溶解在适当的溶剂中，并根据需要进行进一步的前处理步骤，例如过滤、离心或稀释。

确保样品溶液中的待分析物浓度适当，以便在柱上进行分离。

步骤4：柱的条件选择根据所需分离的化合物性质和分析目标，选择合适的反相色谱柱。

反相色谱具有不同的相性，例如C18、C8、CN等，可以根据需要选择不同的柱相类型。

柱相类型的选择将影响柱填料的亲水/疏水性以及化合物分离的效果。

步骤5：柱的平衡在进行样品分离之前，需要进行柱的平衡，以确保柱填料与样品中的化合物充分接触和平衡。

将柱连接到色谱仪，并调整流速，使溶剂在柱内均匀流动。

根据柱的具体要求，可以选择使用等温箱或其他方法控制柱的温度。

步骤6：样品进样将样品进样到柱中。

这可以通过自动进样机、手动装样针或其他进样方式完成。

根据样品的性质和待分离化合物的浓度，确定进样量。

注意，进样前要确保样品完全溶解，并通过过滤等步骤去除悬浮颗粒和其他杂质。

步骤7：分离开始进行分离。

根据柱的条件和步骤5中选择的溶剂体系，调整流速和梯度程序，使样品在柱上逐渐分离。

根据柱的具体要求，可以选择使用梯度洗脱或等温洗脱的方法。

步骤8：检测和记录结果在分离过程中，采用合适的检测方法对柱洗脱液进行检测。

常用的检测方法包括紫外/可见吸收光谱、荧光检测、质谱等。

反相HPLC柱子的清洁和再生反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用最广泛的技术,主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物.大多数用于反相色谱的固定相都是天然的疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小来分离的，含有疏水的机制也能以同样的保留方式分离。

硅胶表面因为有着疏水键合相而有一些别的化学性质。

残留的硅烷醇存在于所有的硅胶键合填料中。

图1描述了不同种类的能出现的硅烷醇,这些硅烷醇具有弱酸性，因此能与某些待分析物合基质成分，特别是碱性成分。

因为硅烷醇的pKa值大约是4.5，离子化能在中性pH条件下发生因此与阳离子产生静电相互作用就有可能发生.较老的A型硅胶能容纳高浓度金属离子（有时候100ppm或更多），而这能使硅胶表面的酸性更大甚至能发生金属鳌合现象或清除一些化合物。

残留硅烷醇在非末端封闭的硅胶合短链键合相如C2或C4上更让人烦恼.使用者必须清楚他们所用的固定相表面特殊性质和可能的分析物－固定相表面的相互作用，这样当他们使用反相方法时才能考虑到可能的基质相互作用。

例如，非常疏水的样品基质如玉米油,高芳香物质，和蜡能粘住固定相装填表面并且改变他们的性质.含有蛋白质物质的生物流体也能吸附在装填表面。

尽管分析者想尽最大努力来保护HPLC柱子,某些分析物－基质污染能使固定相受到有害的影响。

当柱子被污染,它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。

被污染的柱子能产生反压问题。

被污染的反相柱子必须清洗和再生才能恢复原来的操作条件。

这部分的“柱子观察”将讨论可行的方法使柱子回复原来的或差不多原来的状态.因为键合硅胶柱子是最受欢迎的，我重点讲述这种柱子。

最后，我将讨论别的反相柱子的清洁步骤。

1反相柱子污染原因:通常,样品中含有一些对分析者来说不感兴趣的东西。

盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质是一些可能在使用时与HPLC柱发生相互作用的物质。

这些物质有比分析者的目标物或少或大的保留值.那些保留值较小的物质如盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱柱。