PCR实验室设计ppt课件

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引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。

通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。

引物
根据需要扩增的序列长度和特异性要 求，确定引物的浓度和种类。
PCR扩增及产物分析
扩增
在PCR仪中进行扩增反应，设置适当的温度和循环次数，使DNA片 段得以扩增。
电泳分析
将扩增产物进行电泳分离，通过染色或荧光标记等技术对产物进行 分析和检测。
结果判断
根据电泳结果判断PCR扩增是否成功，并对产物进行定性或定量分析。
3
引物合成
将设计好的引物交由专业的引物合成公司进行合 成，得到可用于PCR反应的引物。
反应体系的组成
DNA聚合酶
选择高活性、高保真度的DNA聚合 酶，确保PCR扩增的准确性和特异性。
dNTPs
提供PCR所需的四种脱氧核苷酸，即 dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
缓冲液
提供适宜的酸碱度和离子浓度，维持 DNA聚合酶的活性。
基因突变和突变的检测
基因突变检测
PCR技术可以用于检测基因突变，通过设计特定的引物，可以扩增特定的DNA片段，通过比较正常和异常序列的 扩增产物，可以检测出基因突变的位置和类型。
突变筛选
利用PCR技术可以对大量样本进行突变筛选，通过设计针对特定突变的引物，可以对大量样本进行高通量的突变 检测，有助于疾病的早期发现和治疗。
快速高效
PCR技术能够在短时间内完成DNA的大规模扩增，大大提高了检测效 率。
操作简便
PCR技术流程相对简单，易于操作，使得它在实验室中得到了广泛应 用。
缺点
成本较高
PCR技术所需的仪器、试剂等成本较高， 对于一些经费有限的实验室来说可能是
一个负担。
对样品质量要求高
PCR技术的灵敏度使得其对样品质量 要求较高，样品中微小的杂质或污染

本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意 避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在 使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用 洗板机洗板，废液必须收集至1mol/L HC1中，并 且不能在实验室内倾倒，而应至远离PCR实验室的 地方弃掉。用过的吸头也必须放至1mol/L HCl中浸 泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。
怎样编写SOP？
知识回顾 Knowledge Review
扩增区
PCR 扩增区工作细则 1. 操作者应穿本区工作服，戴双层手套，自核酸样品制备区来者不
必更换手套。 2. 按 PCR 仪操作规程创建自己的反应程序，记录自己的反应程序号，
以后直接运行该程序。 3. 如果创建反应程序过程中，机器出现某程序号与其他程序号相关
联的情况，要另选新的程序号，以免误将别人的程序篡改。 4. 每次运行程序前一定要核对该程序的内容。 5. 运行结束后，及时取出反应管，关闭机器并填写记录，勿使机器
进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺 序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备 区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增 区)至产物分析区，避免发生交叉污染。
在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区 别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作 者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带 出。
清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因， 因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩 增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应 有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物 质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故应 注意实验人员的安全防护。
本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区 如采用负压条件或减压情况下(如安装排风扇)可减 少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。

PCR引物设计
引物决定了PCR产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件，如primer premier5、
Internet免费引物设计网站有primer 3，Primerfinder等。
引物设计有以下几个原则：
（1）引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过
70％的同源性或连续8个的碱基互补，减少非特异产物； （2）引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分，不包括在5’端额外
引物设计软件primer premier 5.0的使用
可通过两个方法将序列输入软件中
打开原有的序列文件
在表中粘贴序列
选择序列文 件所在位置
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ

在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的“Primer”按钮
引物设计界面
对正向和反向引物进行编辑
正向和 反向引 物的互 换 正向和反向 引物的信息 正向和反向 引物的评价
用键盘输入了5个碱基
改动后引物的信息
引物的信息
引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μ M之间。浓度过高易形成引物二聚体 且产生非特异性产物。一般来说用低浓 度引物经济、特异，但浓度过低，不足 以完成30个循环的扩增反应，则会降低 PCR的产率。
引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高 特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合， DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可 造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一 般可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一 般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度 Tm(melting temperature)低5℃，可按公式 进行计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。

精品课件
14
实验室感染
实验室工作人员在实验过程中受到实验室生物 污染而发生的感染
精品课件
15
东北农大师生因动物实验感染严重传染病
❖ 2010年12月，东北农业大学30名学生在实验室进 行“羊活体解剖学实验”，因实验动物购买未按《 黑龙江省实验动物管理条例》，未要求养殖场出 具有关检疫合格证明， 使28人被感染布鲁氏菌病
精品课件
9
临床实验室生物污染的原因及种类
❖ 空气污染 ❖ 水的污染 ❖ 人体污染 ❖ 物体表面的污染
精品课件
10
空气污染
❖ 内： 平面布局、气流方向 —— 合理 死角区域 —— 缩小
❖ 外： 直接外排或扩散 ———— 高效过滤 ———— 密闭或压力差
精品课件
11
水、人体、物体表面污染
❖ 实验过程中产生的大量污水 —— 特殊处理后排放
Laboratory technician Nurse Physician Medical technician/paramedic Dentist/dental technician Health aide/attendant Housekeeper/maintenance worker Morgue technician Technician/therapist Respiratory therapist Surgical technician Other HCW Total
精品课件
5
生物源危害
❖ 来源： 临床实验室中处理的病人标本（细菌、病毒、真菌、 寄生虫）
精品课件
6
❖ 细菌（bacteria）
结核杆菌 Mycobacterium tuberculosis.

dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5， 小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏 低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物 的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓 度降低。
PCR反应的特点
②灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射 免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng和pg级，而PCR检 测灵敏度可达fg级，理论上可检出一个细菌或一个真 核细胞的单拷贝基因的存在；
PCR反应的特点
③简便快速：操作试剂盒时只需将样品简单处理和加 样后即可进行扩增，许多PCR检查项目在两小时左右即 可出报告；④对样品要求低：几乎所有的临床标本都 可用于PCR扩增。
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
PCR技术的用途
科研使用 临床医学 法医学 农业 考古学 人类学 环境保护
个体识别与亲子鉴定 GMO
PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。

产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区当今世界的商业活动进行文化传播是其重要的功能
临床PCR实验 室设计
可编辑课件
1
临床基因扩增检验实验室设计
❖ 依据：卫生部颁发的《临床基因 扩增检验实 验室管理暂行办法》 （卫医发[2002]10号）
扩增区
标本制备区 试剂准备区
空气流向
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
专用走廊
工作流向
可编辑课件
5
理想的PCR实验室设计B
产物分析区
扩增区
标本制备区 试剂准备区
空气流向
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
专用走廊
工作流向
可编辑课件
6
A
扩增区
门 产物分析区
标本制备区 门
门
❖ 《医疗机构临床基因扩增管理法》 (卫办医政发〔2010〕194号)
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2
实验室设计
❖ 空间充分合理的空间 ❖ 良好的照明 ❖ 空调设备
可编辑课件
3
临床PCR实验室设计的一般原则
❖ 各区独立
❖ 注意风向 “十六字口诀”
❖ 因地制宜
❖ 方便工作
可编辑课件
4
理想的PCR实验室设计A
产物分析区
试剂准备区
门
外走廊门Leabharlann B扩增及产物分 析区
标本制备区 门
试剂准备区 门
门
可编辑外课走件廊
门
7
可编辑课件
8
可编辑课件
9
可编辑课件
10
可编辑课件

阳性室内质控物来源：
浓度及批号：
扩增位置：
阴性室内质控物来源：
批号：
扩增位置：
所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：
1
9
17
25
2
10
18
26
3
11
19
27
4
12
20
28
5
13
21
29
6
14
22
30
7
15
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31
8
16
24
32
核酸提取及加样过程：按XXX（列出编号）SOP进行。
仪器设备使用： 生物安全柜： 正常 不正常 恒温仪温度校准： ℃
毫升；
按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯
毫升；
按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制
毫升；
其他：
仪器设备使用：
离心机： 正常 不正常
振荡器： 正常 不正常
实验后： 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，
并进行紫外照射30分钟以上。
空气流向 缓冲间
专用走廊
工作流向
第2页/共66页
理想的PCR实验室设计B
产物分析区
扩增区
标本制备区 试剂准备区
空气流向
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
专用走廊
工作流向
第3页/共66页
PCR实验室设计的一般原 则
“十六字口诀”
第4页/共66页
A
扩增区
门 产物分析区
标本制备区 门
门 试剂准备区

污染原因
(二) PCR试剂的污染:主要是由于在PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双 蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
污染原因
(三) PCR扩增产物污染: 这是PCR反应中 最主要最常见的污染问题，因为PCR产物 拷贝量 大，远远高于PCR检测数个拷贝的 极限，所以极微量的PCR产物污染，就可 造成假阳就可形成假阳性。
扩增反应混合物配制和扩增区
• • • • 核酸扩增仪 微量加样器（覆盖1-1000ul） 可移动紫外灯（近工作台面） 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处 理的离心管和加样器吸头（带滤心） • 专用工作服和工作鞋 • 专用办公用品
扩增产物分析区
视检验方法不同而定。基本仪器设备如下： 1、 微量加样器（覆盖1-1000ul） 2、 可移动紫外灯（近工作台面） 3、 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、 加样器吸头（带滤心） 4、 专用工作服和工作鞋 5、 专用办公用品
污染原因
还有一种容易忽视，最可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液 体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比 较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及 污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而 污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷 贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别 重视的问题.
防止污染的方法
(四) 防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应 一次性使用。
(五) 设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增 条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能 性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被 扩增核酸的样品作阴性对照。
(六) 选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸 的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至 管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。

仪器误差
PCR仪器的性能和稳定性对扩增结果至关 重要，应选择性能稳定、精度高的仪器， 并定期进行维护和校准。
06
pcr 扩增实验展望与未来 发展
pcr 技术的发展趋势
自动化与智能化
随着技术的进步，PCR仪器的自 动化和智能化程度将进一步提高，
减少人工操作，提高实验效率。
高通量与快速检测
未来PCR技术将向高通量和快速检 测方向发展，能够同时检测多个基 因或样本，缩短检测时间。
05
pcr 扩增实验注意事项与 误差分析
实验注意事项
实验前准备
确保实验室环境清洁、无污染，实验 器材灭菌处理，实验试剂储存得当， 避免过期或污染。
操作规范
严格遵守实验操作规程，避免交叉污 染和意外事故。
样本处理
确保样本质量，避免样本降解或污染， 按照实验要求进行样本处理。
实验后处理
及时清理实验废弃物，对实验器材进 行清洗和消毒，保持实验室整洁。
将DNA模板进行必要的处理和纯化，以去 除杂质和不必要的片段。
根据反应体系要求，将DNA模板、引物、 dNTPs、Taq酶等试剂加入PCR管中。
PCR扩增程序设置
PCR扩增执行
根据目标DNA片段的特性和扩增要求，设 置PCR仪的扩增程序（包括变性、退火、延 伸等温度设置和循环次数）。
将配置好的PCR反应混合液放入PCR仪中， 按照设定的程序进行扩增。
pcr 技术的原理
PCR技术的基本原理是利用DNA双链复制的原理，在DNA聚 合酶的作用下，以一对寡核苷酸引物为模板，在适宜的温度 和环境下，进行DNA片段的扩增。
pcr 技术的发展历程
pcr 技术的起源
PCR技术最早由美国科学家凯利·穆 利斯在1983年发明，最初被称为“ 穆利斯放大法”。

PPT课件 15
c. 保存的文件夹及文件标识号：
d. 电子保存的软件备份要求：
每一个月进行一次电子报告的软件备份；
安排在每月的最后一个工作日完成。
PPT课件
16
(2) 记录保存 a.电子数据的保存: 将病例资料、样品资料、检测结果录入 报告系统，产生报告，同时保存记录，记 录人签名 b.书面记录的保存: 书面记录（病例资料和结果记录）装订 保存于报告系统旁的抽屉里，每月进行整 理，所有记录保存两年，两年后交科室统 一建档封存，封存记录的开启须经科主任 同意并委派档案管理人在场。
PCR或RT-PCR试剂盒的组成 PCR试剂盒的分类 影响PCR试剂盒质量的因素 PCR试剂盒质量指标 PCR试剂盒的选用原则

PPT课件
51
1、PCR或RT-PCR试剂盒的组成

核酸提取试剂
标准品与质控品 核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂



产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR方法
PPT课件
56
5、PCR试剂盒的选用原则


参考试剂生产厂家的信息广告 参考同行对有关试剂盒的使用效果 参考有关机构的综合评价 根据使用目的 根据所在实验室的技术特点 医院和患者的承受能力（收费）
PPT课件
48
优点
采用试剂盒标准曲线的斜率与截距以及荧光
背景的噪音和荧光曲线的陡度对其实施动态
质量监控，具有简捷、实用等优点
利用试剂盒标准曲线斜率与截距对定量PCR
进行室内质控，可有效控制因试剂分装质量
(反应液/酶加入量)及酶活性而引发的失控
PPT课件 49
PPT课件
50
四. 临床PCR试剂盒的选用

一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):