限制性内切酶酶切反应的标准操作规程

实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析实验目的：通过限制性内切酶酶切分析，了解DNA的结构和特性，掌握限制性内切酶的使用方法，以及掌握DNAGel电泳技术。

实验原理：限制性内切酶是一类可切割DNA分子的酶，可特异性地识别DNA的特定核苷酸序列并切割它们。

限制性内切酶可以将DNA切割成特定大小的DNA片段，这些片段可以进一步用于基因克隆、DNA指纹分析、DNA测序、DNA杂交等。

将DNA和内切酶一起反应一段时间后，可以通过电泳将酶切后的DNA片段按大小分离，从而得出不同DNA序列的长度和特征，达到对DNA结构特点进行研究的目的。

实验步骤：1. 从实验室提供的细菌菌株中提取DNA样品。

2. 将DNA样品用水稀释到适当浓度。

3. 按照所选内切酶的说明书，将相应量的酶加入DNA样品中。

混匀并放在37℃的水浴中进行反应1-2小时。

4. 制备1%的琼脂糖凝胶。

5. 将酶切后的DNA和DNA加载缓冲液混合后，放入琼脂糖凝胶槽中。

6. 进行DNAGel电泳，根据DNA片段的大小，将DNA分离开。

7. 取出凝胶进行染色，直接观察或用紫外线透射方式扫描成像。

实验注意事项：1. 在实验室中需要严格遵守生物安全措施，避免污染。

2. 在进行内切酶酶切反应时，需要严格按照酶的使用方法进行操作，以保证反应质量和结果准确。

3. 在制备DNA样品时需要避免DNA的降解或氧化。

4. 在进行DNAGel电泳时需小心操作，以避免凝胶破损或电流过强，影响实验结果。

实验结果分析：通过限制性内切酶酶切分析后，可以得到DNA片段的长度和特征，从中了解到DNA的特性和结构。

实验结果需要根据实验方法、酶的选择等进行分析和总结，以便进一步推进科研工作。

酶切操作技巧实验材料实验耗材：枪头（10μl、200μl）、EP管(200μl)试剂：限制性内切酶及buffer、ddH2O准备工作：冰，37˚C水浴、质粒或PCR产物实验操作步骤：酶切反应体系成分体积（µL）质粒或PCR产物<1µgBuffer2限制性内切酶1 1限制性内切酶2 1ddH2O Up to 2037˚C水浴2h。

注意事项：1. 尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的buffer，以及各酶在公用buffer里的效率。

2. 双酶切时间及其体系：一般酶切2个小时，酶切效率低的可适当延长时间，酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul 体系中酶解1ug DNA。

3. 两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。

4. 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer 能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。

如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。

第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。

厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。

有的酶可以用加热使之失活，如CIAP；有的则不行。

5. 酶量的问题：不同公司的酶活力单位不同，按说明书的酶切体系添加酶量，按反应条件进行酶切反应。

实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。

限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。

一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。

许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。

例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。

5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。

限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。

根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。

根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。

小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。

本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。

在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。

在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。

二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。

2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。

DNA限制性内切酶酶切分析一、原理限制性内切酶和基因载体是DNA重组技术中的两个极其重要的方面。

限制性内切酶是首先在大肠杆菌中发现的能够分解外来DNA的核酸酶。

与核酸外切酶相比，该酶可从DNA双链内部特异的核苷酸序列处将DNA双链切断，产生带有粘性或平头末端的DNA片段。

把要克隆的外来DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割，即可产生带有相同粘性末端的DNA片段。

如果同时用两种不同的酶切割，则可产生带不同粘性末端的片段，通过电泳分离出所需要的目的基因片段。

把目的基因与切开的载体DN A混合，再经过DNA连接酶处理，转化和筛选即可得到希望的重组子。

进行DNA酶切时，根据具体情况可用单酶切或双酶切。

特定的酶有其配套的缓冲液。

进行双酶切时，应选用两种酶都适合的缓冲液；如果两种酶要求的温度不同时，先在较低温度下酶切，然后在较高的温度下酶切。

二、目的了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构，掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。

三、材料、试剂与器具1、DNA样品。

2、限制性内切酶。

3、10×限制性内切酶反应缓冲液。

4、无菌双蒸水。

5、0.5M EDTA (pH 8.0)溶液。

6、10×TBE buffer。

7、琼脂糖。

8、溴化乙锭溶液。

9、上样缓冲液（40%蔗糖，0.25%溴酚兰）。

10、微量离心管、微量加样器、水浴锅、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽。

11、10mg/ml Rnase。

四、操作步骤1、将在－20℃保存的DNA样品和10×限制性内切酶反应缓冲液取出，放在冰浴上融化待用。

2、取一干净无菌的微量离心管,按顺序加入以下组分：DNA样品 0.1-2mg10×内切酶反应缓冲液 1ml内切酶1 1ml内切酶2 1ml加无菌水至 10ml3、离心1秒钟，使管壁上的溶液集中到管底。

用手指轻弹管底部位使之混合，再离心一次，使管壁上的溶液集中到一起。

4、在37℃温育60－120分钟。

DNA的限制性内切酶酶切实验目的1.掌握DNA限制性内切酶酶切的原理与实验方法。

2.了解限制性内切酶的特点。

实验原理限制性内切酶是基因工程中剪切DNA分子常用的工具酶，它能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键。

根据限制性内切酶的组成、所需因子及裂解DNA的方式不同可分为三类，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

重组DNA技术中所说的限制性内切酶通常指Ⅱ型酶。

绝大多数Ⅱ型酶识别长度为4～6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。

实验器材移液器、移液器吸头、1.5ml离心管、离心管架、水浴锅、离心机、制冰机、漂浮板等。

实验试剂（1）DNA样品：质粒pUC19和基因3055。

（2）限制性内切酶、BamH I和EcoR I。

（3）通用型DNA纯化回收试剂盒（试剂盒组成见本篇“实验四DNA片段的纯化与回收”）。

实验操作（1）取2支离心管，在冰上按以下顺序分别配制酶切反应体系（50μl）：质粒pUC19/基因3055 43μl限制性内切酶5μlBamH I 1μlEcoR I 1μl（2）加完反应体系后，用手指弹管壁混匀，短暂离心，使反应液甩入离心管底部。

（3）将离心管插入漂浮板上，放置于水浴锅中，37℃水浴15min，然后80℃加热20min终止反应。

（4）使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物。

注意事项（1）注意要在冰上操作。

（2）加入限制性内切酶时，移液器吸头应贴着离心管壁沿着液面加入。

实验意义限制性内切酶是重组DNA技术中常用的工具酶，在体外构建重组载体时，用于特异性切割载体及目的基因。

思考题如何根据载体和目的基因选取合适的限制性内切酶？。

酶切操作流程酶切是分子生物学领域中常用的一种技术，它可以通过切割DNA 分子中的限制性内切酶切位点来获得所需的DNA片段。

本文将介绍酶切的操作流程，包括DNA制备、酶切反应、凝胶电泳和回收纯化等步骤。

一、DNA制备首先需要从细胞或组织中提取DNA，常用的方法包括CTAB法、盐法、商用DNA提取试剂盒等。

在DNA提取过程中需要注意以下几点： 1. 样品的选择：样品的选择应根据实验需要进行，如想要提取植物DNA，则需要选择新鲜的植物材料。

2. 细胞破碎：细胞破碎是DNA提取的关键步骤，可以采用机械破碎、化学破碎、超声波破碎等方法。

3. DNA纯化：提取的DNA需要经过纯化处理，如使用酚/氯仿法、硅胶柱等方法。

二、酶切反应在DNA制备完成后，需要将DNA加入限制性内切酶反应体系中进行酶切。

酶切反应需要注意以下几点：1. 选用合适的酶：根据实验需要选择合适的酶，如EcoRI、BamHI、HindIII等。

2. 反应体系的配制：反应体系包括酶、DNA、缓冲液和水，需要按照酶的使用说明书进行配制。

3. 反应条件的控制：酶切反应需要控制反应时间、反应温度和反应缓冲液pH值等条件，以保证反应的效果。

三、凝胶电泳酶切反应完成后，需要进行凝胶电泳检测，以确定所得DNA片段的大小和纯度。

凝胶电泳需要注意以下几点：1. 凝胶的选择：凝胶的选择应根据所需检测的DNA片段大小进行，如需要检测100bp以下的DNA片段，则需要选择1%琼脂糖凝胶。

2. 电泳条件的控制：电泳条件包括电场强度、电泳时间和电泳缓冲液pH值等，需要根据凝胶的选择和实验需要进行调整。

3. 显色染色：电泳结束后需要进行显色染色，如使用乙溴酸溶液染色，以显示DNA片段的大小和数量。

四、回收纯化通过凝胶电泳可以确定所需的DNA片段，需要将其从凝胶中回收并进行纯化处理。

回收纯化需要注意以下几点：1. 切割凝胶：可以使用切割刀或针头将所需的DNA片段从凝胶中切割出来。

双酶切连接反应之全攻略一、实验原理：1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个具有互补末端的DNA片段。

2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接在一起。

3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。

二、实验步骤：1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。

2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。

3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将目标片段分离出来，然后进行片段纯化。

4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据连接酶的适宜条件进行连接反应。

一般而言，反应体系中还需要包含ATP供能和缓冲液等。

5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。

6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。

三、实验注意事项：1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位点和连接效率。

合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异性连接。

2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。

3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。

同时需要注意反应缓冲液的pH和温度等条件。

4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。

同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。

5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连接的序列进行分析，确保连接正确。

四、实验应用：1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。