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基因打靶技术在基因治疗中的应用研究随着科技的不断进步和人类对基因的认知不断加深，基因治疗已经成为目前生物医学领域的一个热点研究方向。
而基因打靶技术作为基因治疗中的关键技术之一，具有极大的潜力和前景。
一、基因治疗的定义和技术路线基因治疗是利用基因工程等技术手段，修复或替换人体细胞或组织中缺乏或异常的基因，治疗基因疾病的一种新型治疗方法。
基因治疗技术的基本路线为：构建治疗基因载体，将治疗基因载体导入患者体内，使其达到治疗目的。
二、基因打靶技术的定义和研究进展基因打靶技术是指通过分子遗传学技术寻找特定基因，选定治疗目标基因，研发相应的基因治疗药物，增强治疗效果，减少不良反应和副作用的技术手段。
随着生命科学的发展，基因打靶技术也逐渐成熟。
例如，目前已经有基于基因打靶技术开发的CAR-T细胞疗法、CRISPR/Cas9基因编辑技术等。
这些技术的成功应用使得基于基因打靶技术的基因治疗开始进入实际应用阶段。
三、基因打靶技术的优势和不足相比于传统的治疗方法，基于基因打靶技术的基因治疗在很多方面具有明显的优势。
例如，它能够精确定位治疗目标，防止将治疗药物引入错误的细胞或组织中。
同时，基因打靶技术能够减少不良反应和副作用，提高治疗效果。
但是，基因打靶技术也存在一些不足之处。
其中一个主要问题是基因打靶技术难以获得指定的治疗效果，因为基因在人体内的调控非常复杂。
此外，基因治疗在实际应用中的安全性和有效性也需要得到进一步的验证。
四、基因打靶技术在基因治疗中的应用基因打靶技术在基因治疗中有多种应用方式。
例如，可以利用基因打靶技术研发出针对特定疾病的基因药物，帮助患者达到治疗目的。
同时，基于基因打靶技术的CRISPR/Cas9基因编辑技术也可以在基因治疗中发挥重要作用，例如在癌症治疗中使用。
此外，基因打靶技术还可以用于：研究基因表达调控网络，发现新的治疗靶点；研究基因遗传变异，寻找遗传性疾病的发生机制以及治疗方法等。
五、结语基因治疗作为一种新型的治疗方式，正得到越来越多的关注和研究。
基因打靶技术在构建基因敲除或敲入细胞系中的应用时文涛，邵荣光（中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京100050）摘要：同源重组介导的基因打靶技术是一项判定哺乳动物基因功能的强有力工具。
在过去的十几年中，应用于转基因小鼠的基因敲除∕敲入技术经过必要的完善后进一步被应用于人源细胞。
本文介绍了在人源细胞系中基因打靶技术应用的优势与局限性、可应用细胞系的选择、基因打靶的基本方法，并比较系统地讲解了重组腺相关病毒介导的基因打靶的实验设计，以使读者对这项技术的应用有一个基本的了解。
关键词：基因打靶；基因敲除∕敲入；重组腺相关病毒The Application of G ene T argeting T echnology in C onstructionstructing ng G eneK nockout and K nockin C ell L inesWen-tao Shi，Rong-guang Shao（Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College,Beijing100050,China）Abstract：Homologous recombination-mediated gene targeting technology is the most powerful technique available for analysis of mammalian gene function.Over the past decade years,the methods used to generate knockout and knockin mice have been modified for use in cultured human cells.In this paper,the advantages and limitations of gene targeting technology,suitable cell lines for gene targeting and the basic method for generating knockout/knockin cell lines are introduced.Moreover,we also systematically describe the experimental design of rAAV-mediated gene targeting to enable readers to basically understand the application of this technology. Key words：Gene targeting；Knockout；Knockin；rAAV基金项目：教育部博士点基金（No:20070023017）同源重组介导的基因敲除（knockout）∕敲入（knockin）技术是一项判定基因功能的强有力工具，这种基因打靶技术已经帮助人们在一定程度上认识了某些细胞或动物个体异常表型的遗传基础。
基因打靶技术研究进展及其应用王建刚西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌 712100摘要：基因打靶技术是2O世纪8O年代发展起来的新技术，是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞（ES细胞）技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的实验手段，具有定位性强、打靶后新的基因有随染色体DNA稳定遗传的特点，其方法包括基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等，相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获技术等。
为生命科学、基因组学和疾病治疗等领域的研究提供了强大的工具。
文章将主要介绍基因打靶技术的发展简史、近期进展以及在模式动物中的应用。
关键词：基因打靶同源重组 ES细胞转基因动物基因治疗瑞典皇家卡罗琳外科医学研究院诺贝尔生理学或医学奖评审委员会2007年l0月8日宣布，美国科学家卡佩基（Mario R Capecchi）、史密斯（Oliver Smithies）和英国科学家埃文斯（Martin J Evans）因在“涉及使用胚胎干细胞进行小鼠特定基因修饰方面的一系列突破性发现”而获得2007年度诺贝尔生理学或医学奖。
这三位科学家的研究工作为“基因打靶”（gene targeting）技术奠定了基础。
1 基因打靶技术1.1 基因打靶的概念基因打靶就是利用细胞染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质，通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点，以达到定点修饰和改造染色体上某一基因为目的的一项技术。
通过基因打靶技术可以对生物体（尤其是哺乳动物）基因组进行基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体大片段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系遗传，使遗传修饰生物个体表达突变性状成为可能。
1.2 基因打靶技术建立的意义“基因打靶”技术是分子生物学技术上继转基因技术之后的又一革命。
它“开创了全新的研究领域”，克服了基因随机整合的盲目性和危险性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法，尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确，它的发展为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供一个全新的研究手段；它的应用涉及基因功能的研究、生产具有商业价值的转基因动物和植物、异体动物器官移植和人类疾病的基因治疗对攻克人类疾病等诸多方面起到了重大作用，该技术一经公布，就广泛应用于基因功能研究、生物制药等方面。
基因敲除技术在细胞功能研究中的应用生命科学是一个跨学科的领域，其中涉及了生物学、化学、医学等学科的知识。
其中，基因敲除技术是生命科学领域中的重要技术之一。
通过对细胞中的某个基因进行敲除，可以观察到该基因在细胞中所扮演的角色以及对细胞功能的影响。
在本文中，将深入探讨基因敲除技术在细胞功能研究中的应用。
一. 基因敲除技术的基本原理基因敲除技术首先要了解的是CRISPR/Cas9系统，它是一种分子生物学技术，可以精准地切除特定的DNA序列。
这个系统主要由两部分组成：CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）和Cas9（CRISPR-associated protein 9）。
CRISPR是由一系列基因组成的微小重复序列，这些序列中间间隔着一些维持不变的“桥梁”序列。
而Cas9就是一个酶，能够在特定的DNA序列上切割，从而实现基因敲除。
二. 基因敲除技术的应用1. 确认基因在生物学中的功能基因敲除技术可以用来对细胞中的激素、受体和信号途径进行研究，从而了解它们在细胞功能中的作用。
比如说，在之前的实验中，研究者使用基因敲除技术，查明了人类细胞生长激素有助于肝脏对葡萄糖的代谢，同时也可以增强胰岛素对于葡萄糖的抑制作用。
这种技术也可以用于研究每个基因与各自相关的特定表型，并建立基因组愈创木模型。
2. 揭示基因和癌症的关系基因敲除技术能够在癌症方面发挥大量的作用，这是因为在癌症中，信号通路的异常会导致细胞增殖及不断分裂。
因此，通过人工干涉这种信号通路的特定基因，就可以寻找并验证与癌症治疗相关的新靶标。
这种技术在小鼠中研究和测试，能够帮助研究者揭示癌症生长的细节。
3. 发现新的治疗方式基因敲除技术已被广泛用于基因治疗及基因编辑。
通过精确地引导Cas9蛋白，可以破坏患者特定基因上的变异位点，然后通过携带更多的正常基因来替换它。
基因打靶技术在构建人源体细胞基因敲除或敲入细胞系中的应用时文涛;邵荣光【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2008(003)004【摘要】基因打靶技术能够帮助人们认识某些动物个体或细胞表型异常的遗传基础，利用该技术构建的模式生物（例如基因敲除小鼠）已经广泛地应用于人类基因的研究，截至1999年就已经报道了800多个模式小鼠种系。
同源重组介导的基因打靶技术（基因敲除或敲入）是判定基因功能的强有力工具。
与基因敲除小鼠相比，人类体细胞基因敲除或敲入细胞系构建的报道相对较少，但该项技术在细胞水平上对某些人源基因参与的生化或生理途径的分析是不可替代的。
基因打靶技术最常见的应用是通过使所有等位基因连续失活建立基因敲除细胞系；【总页数】4页(P297-300)【作者】时文涛;邵荣光【作者单位】100050,北京,中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所;100050,北京,中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.CRISPR/Cas9系统介导的EZH2基因定点敲入Hut78细胞系的构建 [J], 鲁卓林;杨冰;赵秀娟;王青松;韩春勇;张玲;孙琰;熊显佳;吴云丹;周慧;贾军;王双林;武莉莉;刘艺洁;乔阳2.应用改良体细胞基因敲入技术内源标记跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDD1的研究 [J], 宋伟;李尚泽;张慧慧;缪时英;王琳芳;张晓东;杜润蕾3.猴源cathepsin基因shRNA文库及其稳定敲减细胞系的构建 [J], 魏宇双;杨国宇;刘姣扬;韩莹倩;郭珍珍;刘晓贺;巴根;韩立强;王江;褚贝贝4.稳定表达敲入增强绿色荧光蛋白标记的干扰素γ受体2基因Ifngr2的黑素瘤细胞系的构建与鉴定 [J], 樊浩;周涛;李卫华5.利用基因打靶技术构建血管内皮特异性Stk24/25双基因敲除小鼠 [J], 高睿;郑祥建因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一、实验背景基因打靶技术是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内研究基因及基因组的功能。
近年来，基因打靶技术在生物学和医学研究领域取得了显著成果。
本实验旨在通过基因打靶技术，研究特定基因在细胞增殖、凋亡和信号传导等方面的功能。
二、实验目的1. 利用基因打靶技术构建基因敲除细胞系。
2. 研究敲除特定基因后，细胞在增殖、凋亡和信号传导等方面的变化。
3. 分析敲除特定基因后，细胞生物学特性的变化。
三、实验材料1. 细胞：人乳腺癌细胞系MCF-7。
2. 基因打靶载体：pT7-TET-OFF载体。
3. 试剂：质粒提取试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂、转染试剂等。
四、实验方法1. 构建基因打靶载体：将目的基因插入pT7-TET-OFF载体中，并使用限制性内切酶进行酶切，连接成重组质粒。
2. 细胞转染：将重组质粒转染MCF-7细胞，采用脂质体介导的转染方法。
3. 基因敲除细胞筛选：通过G418筛选阳性克隆，并进行PCR检测。
4. 细胞增殖实验：采用CCK-8法检测细胞增殖情况。
5. 细胞凋亡实验：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。
6. 信号传导实验：采用Western blot法检测信号传导相关蛋白的表达。
五、实验结果1. 成功构建基因敲除细胞系：通过PCR检测，确认目的基因在细胞中成功敲除。
2. 基因敲除细胞增殖能力下降：CCK-8实验结果显示，基因敲除细胞增殖能力明显低于野生型细胞。
3. 基因敲除细胞凋亡率升高：Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示，基因敲除细胞凋亡率显著高于野生型细胞。
4. 信号传导实验结果显示，基因敲除细胞中信号传导相关蛋白表达降低。
六、实验讨论1. 本实验成功构建了基因敲除细胞系，为研究特定基因的功能提供了实验基础。
2. 基因敲除细胞增殖能力下降、凋亡率升高，提示该基因可能参与细胞增殖和凋亡调控。
基因敲除方法的原理应用1. 概述基因敲除是一种常用的遗传学实验技术，通过将目标基因从细胞或生物体中删除，以研究基因在生物体中的功能和调控机制。
本文将介绍基因敲除方法的原理和常见应用。
2. 基因敲除方法的原理基因敲除方法主要包括两个步骤：构建敲除基因载体和敲除基因导入目标细胞或生物体。
2.1 构建敲除基因载体1.确定目标基因：首先需要确定要敲除的目标基因。
可以通过文献资料和数据库查询，分析基因序列和功能等信息，选择合适的目标基因。
2.设计敲除基因：设计针对目标基因的敲除基因，通常采用DNA重组技术构建。
敲除基因通常包括选择标记基因和目标基因序列特异性引物。
3.构建敲除基因载体：将设计好的敲除基因插入适当的载体中，如质粒或病毒载体。
2.2 敲除基因导入目标细胞或生物体1.选择合适的敲除基因导入方法：根据目标细胞或生物体的特性和要求，选择合适的基因导入方法，常见的方法包括细胞转染、病毒载体导入和转基因动物等。
2.导入敲除基因：将构建好的敲除基因载体导入目标细胞或生物体中，通过基因重组等技术使敲除基因与目标基因发生相应的重组事件。
3. 基因敲除方法的应用基因敲除方法被广泛应用于基因功能研究、药物研发、疾病模型构建等领域。
以下列举几个常见的应用案例：3.1 基因功能研究通过基因敲除方法，可以在细胞或生物体中敲除目标基因，观察其对生物体的影响，以揭示目标基因在生物体中的功能和调控机制。
例如，敲除特定的转录因子基因，可以研究其对基因表达和细胞分化的影响。
3.2 药物研发基因敲除方法可以用于筛选药物靶点和评估药物疗效。
通过敲除潜在的靶点基因，观察其对疾病模型动物的影响，以评价该靶点的重要性和药物的效果。
这对于药物研发和治疗策略的选择具有重要意义。
3.3 疾病模型构建利用基因敲除方法，可以构建基因敲除动物模型，模拟特定疾病的发生和发展过程。
通过敲除与疾病相关的基因，可以研究疾病的发病机制、病理过程和药物治疗的有效性。
基因敲入敲出技术在基因功能研究中的应用随着基因工程技术的不断发展，各种新的基因操作技术也接踵而至，其中基因敲入敲出技术作为一种较为成熟的技术，已经在基因功能研究中得到了广泛的应用。
本文将从基因敲入敲出技术的原理、方法和应用等方面进行探讨。
一、基因敲入敲出技术的原理和方法基因敲入敲出技术主要是指将人工合成的DNA片段通过某种方式导入到生物体内，从而达到某种特定的目的，如研究基因功能、治疗基因疾病等。
基因敲入敲出技术主要有以下几种方法：1. 基因转染基因转染是通过化学方法将外源基因材料转移到细胞内，达到基因敲入的目的。
目前常用的基因转染方法有磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、电击法、微波和激光法等。
基因转染方法成本相对较低，但是效率较低，且对不同的细胞型号、组织和物种的适应性差异较大。
2. 基因炮击基因炮击是一种基因敲入技术，它利用高压氦气或金属微粒将外源DNA粒子加速到指定的细胞表面，使得DNA颗粒穿过细胞膜，达到基因敲入的目的。
这种方法的优点是能够高效地传递基因材料，并且适用于不同种类的细胞。
3. 基因酶基因酶是一种通过利用蛋白质工具进行基因敲入和敲出的技术。
目前常用的一种基因酶是锌指核酸酶（ZFN），它是一类利用酶切技术将外源DNA片段剪切下来并导入到指定的位置上，从而达到基因敲入效果的技术。
基因酶方法的优点是能够准确控制敲入部位和效果，但是缺点是使用成本较高，并且需要专业技术支持才能实现。
4. CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9技术是近年来较为流行的一种基因敲入技术，它通过利用CRISPR/Cas9蛋白复合体与著靶基因结合，进一步将原来DNA序列精准地“剪切”并实现普通基因编辑、点突变和基因组插入等操作。
CRISPR/Cas9技术因为其操作简单、成本低廉等特点而备受关注，对于基因编辑疗法等方面的研究具有广阔的应用前景。
二、基因敲入敲出技术在基因功能研究中的应用基因敲入敲出技术在基因功能研究中的应用主要包括以下几个方面。
基因敲除技术及其在生物研究中的应用近年来，基因敲除技术（gene knockout technology）已成为生物学研究领域中不可或缺的重要技术之一。
该技术能够精确地剔除或破坏细胞或整个生物体中的特定基因，从而实现对基因功能的研究。
本文将重点介绍基因敲除技术的原理、种类以及在生物研究中的应用。
一、基因敲除技术原理1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9技术是一种革命性的基因编辑工具，该技术利用一种具有双链DNA特异性的内切酶（Cas9）和靶向指导介导RNA（sgRNA）定向切割特定位点上的DNA序列，并导致该位点的失活或突变。
CRISPR/Cas9技术可以在较短的时间内实现基因定向编辑，而且其费用相对较低，操作也较简便。
2. 基因减数（Gene Targeting）技术基因减数技术使用过表达的选择标记基因替代靶向基因的一部分或全部，从而影响某个功能位点的进行或基因的表达量。
该技术需要细胞亚群培养、DNA序列的构建以及线性化质粒的导入，较为繁琐。
二、基因敲除技术种类基因敲除技术目前主要包括自然敲除、随机敲除和定向敲除。
1. 自然敲除自然敲除是指基因在自然环境下发生的突变或是某些生物的天然遗传性基因缺失，是基因研究者最早采用的敲除技术，但该方法往往不够精确，且难以回答基因对生物的功能影响和调控机制。
2. 随机敲除随机敲除是指将DNA序列尽可能高概率地插入基因组的某些区域，从而引起敲除。
该方法优点是适用范围广，但结果通常是不确定的，并且有可能影响其他基因的表达。
3. 定向敲除定向敲除技术是指选择一个特定的靶向DNA序列，通过人工方式造成抑制、破坏、缺失等方式敲除基因。
该方法比较精确，能够针对特定位点进行基因改变，但制备成本较高。
三、基因敲除技术在生物研究中的应用基因敲除技术应用非常广泛，其中一些应用如下：1. 基因功能研究通过敲除或采用突变诱导的方式，探索基因的功能、调控机制及其与疾病和发育的相关性。
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种革命性的生物工程工具，它利用细菌体内天然存在的免疫系统来精确修改基因。
自从2012年首次引入以来，CRISPR-Cas9已经被广泛用于改变生物学研究和医学治疗的方式。
本文将介绍CRISPR-Cas9的原理、应用方法，并总结其在不同领域的应用。
### CRISPR-Cas9的原理CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古生菌基因组中的DNA序列，它记录了它们所受到的外来病毒基因组的片段。
Cas9是CRISPR系统中的一种蛋白质，具有剪切DNA 的能力。
利用这种系统，科学家们成功将CRISPR-Cas9技术应用于编辑生物体的基因。
CRISPR-Cas9系统的工作原理如下：1. 选择目标基因：确定需要编辑的特定基因序列，并设计与其互补的RNA引导分子（sgRNA）。
2. sgRNA的结合：通过合成互补基因组DNA片段成为单链RNA，与Cas9蛋白结合成一个复合物。
3. 定位到基因组：CRISPR-Cas9复合物进入靶细胞，通过与目标基因的序列互补对应，定位到特定的基因位点。
4. 剪切DNA：Cas9蛋白通过剪切DNA的方式精确修改目标基因，形成双链断裂。
5. 修复机制介入：细胞自身的DNA修复机制介入，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式修复双链断裂。
6. 基因修复：通过修复机制，引入目标基因的缺陷或修复，实现基因编辑。
### CRISPR-Cas9的应用方法CRISPR-Cas9技术的应用方法主要包括基因敲除、基因敲入和基因打靶等。
下面将详细介绍这些方法：#### 1. 基因敲除基因敲除是指通过CRISPR-Cas9技术使目标基因完全失活。
其步骤如下：- 设计sgRNA：选择目标基因的外显子序列，设计与之相互配对的sgRNA。
基因打靶技术在构建基因敲除或敲入细胞系中的应用时文涛，邵荣光（中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京100050）摘要：同源重组介导的基因打靶技术是一项判定哺乳动物基因功能的强有力工具。
在过去的十几年中，应用于转基因小鼠的基因敲除∕敲入技术经过必要的完善后进一步被应用于人源细胞。
本文介绍了在人源细胞系中基因打靶技术应用的优势与局限性、可应用细胞系的选择、基因打靶的基本方法，并比较系统地讲解了重组腺相关病毒介导的基因打靶的实验设计，以使读者对这项技术的应用有一个基本的了解。
关键词：基因打靶；基因敲除∕敲入；重组腺相关病毒The Application of G ene T argeting T echnology in C onstructionstructing ng G eneK nockout and K nockin C ell L inesWen-tao Shi，Rong-guang Shao（Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College,Beijing100050,China）Abstract：Homologous recombination-mediated gene targeting technology is the most powerful technique available for analysis of mammalian gene function.Over the past decade years,the methods used to generate knockout and knockin mice have been modified for use in cultured human cells.In this paper,the advantages and limitations of gene targeting technology,suitable cell lines for gene targeting and the basic method for generating knockout/knockin cell lines are introduced.Moreover,we also systematically describe the experimental design of rAAV-mediated gene targeting to enable readers to basically understand the application of this technology. Key words：Gene targeting；Knockout；Knockin；rAAV基金项目：教育部博士点基金（No:20070023017）同源重组介导的基因敲除（knockout）∕敲入（knockin）技术是一项判定基因功能的强有力工具，这种基因打靶技术已经帮助人们在一定程度上认识了某些细胞或动物个体异常表型的遗传基础。
应用这种技术产生的模式生物（例如基因敲除小鼠）对人类基因进行研究已经广泛开展[1]，早在1999年就有超过800个小鼠种系被报道[2]。
比较基因敲除小鼠而言，对人类体细胞基因敲除或基因敲入细胞系构建的报道相对较少，但这项技术对于在细胞水平上分析某些人源基因参与的生化或生理途径是不可替代的。
基因打靶技术最常见的应用是通过连续使所有等位基因失活，建立基因敲除细胞系。
另外，这种技术还可以用于将外源序列引入内源基因，建立基因敲入等位基因，小到引入单碱基替换，大到引入报告基因[3]。
本文主要介绍了基因打靶技术的基本原理以及最近发展起来的腺相关病毒介导的基因打靶技术的基本应用。
1基因打靶技术应用的优势与局限性迄今为止，在所有使细胞系中特定基因失活的技术中，应用最多的是引起基因表达下调的RNA干扰（RNAi）技术。
与同源重组介导的基因打靶技术相比，RNAi技术应用起来更方便、快捷，成本较低，且适合于高通量筛选[4]。
但是，RNAi结果在不同的实验室及不同的实验之间会有一定差别，而且RNAi只能用于下调而不能彻底消除基因的表达，故其不能用于不同遗传变异体之间的比较，无法彻底取代基因敲除∕敲入技术。
其他的一些基因操作技术，例如过表达显性失活突变，也取得了相当的成功，但其明显不能精确地重演自然发生的遗传改变。
由此可见，基因敲除∕敲入技术有其独特性，可以用于帮助解决许多用其他实验方法无法解决的问题。
像所有实验系统一样，针对人体细胞的基因敲除∕敲入技术既有其独特的贡献，也有明显的局限性，最主要的局限性是这项技术大多应用于培养的人肿瘤细胞。
在肿瘤细胞形成时会产生很多获得性或选择性遗传改变，从而使肿瘤细胞与正常细胞有很明显的差别[5,6]，所以当我们应用一种遗传背景不完全清楚的细胞系时，就应该非常小心。
另外，这种遗传不稳定性在细胞培养过程中还可能产生获得额外的、无法预期突变的亚克隆，在理论上会混淆对表型的分析[7]。
在实际操作中，细胞基因组中自发的改变会随机发生，但是其发生的频率较低，在可接 受的范围内。
例如，错配修复缺陷细胞发生突变的频率比正常细胞高三个数量级，但突变主要发生在重复序列元件中，每代每个碱基的突变频率大约为10-8。
经过认真的设计和适当的对照实验，可以将遗传不稳定性造成的干扰降到最小。
例如，通过比较亲代细胞、独立的靶向基因敲除∕敲入细胞以及非靶向细胞，我们对目的基因功能分析的结果就会具有较高的可信度。
2基因打靶细胞系的选择与基因打靶的基本方法用于基因打靶细胞系的选择是很重要的。
由于产生纯合的基因敲除∕敲入等位基因需要反复打靶，所以选择二倍体或近二倍体细胞对实验最为便捷，大多数具有稳定染色体组的二倍体肿瘤细胞系是具有错配修复缺陷的[7]。
迄今为止，在基因打靶中应用最广泛的是错配修复缺陷的结肠癌细胞系HCT116和DLD1。
当然还有一些细胞系也曾被用于基因打靶，包括其他肿瘤细胞系以及正常组织细胞系，但也有很多未经验证的细胞系很可能不适合基因打靶，所以我们应该尽量选择经过验证的细胞系。
人们设计了多种方法用于基因的改造，其成功率和效率差别很大，而最直接的方法就是利用构建好的含外源基因的载体转入细胞与内源基因进行同源重组。
用于体细胞打靶的方法与构建基因敲除小鼠的方法相似，在两种方法中，都包括四个基本的步骤：（1）设计并构建打靶载体，载体中包括两段同源区及在两段同源区之间的筛选标记，（2）将打靶载体高效转入目的细胞，（3）在一定的筛选条件下，使稳定整合筛选标记的克隆扩增，（4）鉴定并大量扩增发生同源重组而非随机重组的细胞克隆。
除了上述基本的步骤外，对人源细胞的打靶又有独特的要求，需要对用于小鼠的标准方法进行修改。
首先，外源DNA整合进人类细胞基因组的效率比整合进小鼠基因组的效率低，这就使大量转基因克隆的产生变得相对困难。
其次，人类基因组大小约为小鼠基因组的三倍，有证据显示培养的人源细胞中同源重组效率较低[8]。
最后，人源细胞与小鼠细胞相同，一般为二倍体，在小鼠中杂合子可以通过回交（back crossing）变为纯合子，这在人源细胞中显然不能实现，所以多个等位基因需要逐个敲除∕敲入才能获得纯合克隆。
在以上四个步骤中，打靶载体的构建是后续实验的基础，决定了同源重组的位点及重组效率，所以打靶载体的选择与构建就显得尤为关键。
3重组腺相关病毒介导的基因打靶在基因打靶技术应用的早期，一般以质粒为骨架构建打靶载体，再通过电转化的方法将载体转入目的细胞系。
例如，Brown等[9]成功在人正常二倍体成纤维细胞中敲除p21基因，揭示了p21与细胞衰老间的关系。
Chan等[10]在HCT116细胞系中成功敲除14-3-3σ基因，证明这个基因在DNA发生损伤后参与维持G2期检验点并阻止细胞死亡。
Ku86在哺乳动物中的非同源末端连接中起非常关键的作用，敲除Ku86产生的杂合子HCT116细胞，其增殖速度减慢，p53表达水平增高，而敲除的纯合子细胞在经过几次分裂后就发生凋亡[11]。
以上实验取得了很大的成功，但是在上述实验中，载体转入细胞及整合进特异位点的效率较低，增加了实验的成本和操作的复杂性。
重组腺相关病毒（rAAV）载体的出现在一定程度上克服了上述缺点。
Russell等[12]发现rAAV载体中的外源DNA序列整合进染色体同源位点的效率较高，有证据证明其效率比质粒载体高25倍[13]。
由于细胞表面的腺相关病毒受体广泛分布于各种人体组织中，所以包装好的rAAV 病毒颗粒可以高效转染各种人源细胞。
另外一个对基因打靶技术的改进是启动子捕获载体（promoter trap vector）的应用。
典型的例子是应用于小鼠胚胎干细胞的打靶载体，包含一个由强启动子驱动的筛选标记基因，这种筛选元件在染色体上发生随机重组时也会稳定表达筛选标记，产生非目的打靶克隆，增加了筛选的工作量。
Sedivy等[8]发现，当筛选标记基因的表达依赖于内源目的基因的启动子，就可以使所有转基因克隆中产生同源重组克隆的比例大大增加，这项技术就叫做启动子捕获技术。
Bunz等[13]设计了一个通用的筛选元件，从元件的上游到下游包含剪接受体（Splice acceptor, SA）、IRES序列（internal ribosomal entry sequence），筛选标记基因以及多聚腺苷酸尾，将这个元件命名为SEPT（synthetic exon promoter trap），用于构建启动子捕获载体。
在SEPT的两侧，还包括loxP位点，从而可以通过Cre重组酶将筛选基因切除（见图1a）。
需要说明的是，这项技术需要一个有活性的内源启动子，所以被打靶的基因必须是在正常生长条件下持续表达的基因[14]。
rAAV打靶载体和启动子捕获技术的应用在很大程度上提高了产生同源重组细胞克隆的效率，优化了转基因克隆产生的条件，缩小了克隆筛选的范围，使阳性克隆的产生率达到1%以上[3]。
应用上述改进的基因打靶方法，研究人员在细胞水平上对肿瘤的凋亡、生长、转移等许多方面有了进一步的认识，有很多的基因敲除∕敲入细胞系还被用于新药研发及对药物靶点的验证[3]。
图1：同源重组介导的基因敲除/敲入。
(a)基因打靶载体中的功能元件，主要是两条同源臂及中间的筛选标记；SEPT 通用筛选元件，包括一个剪接位点、一个IRES 序列、新霉素转移酶编码序列（neo ）以及一个多聚腺苷酸尾；这个筛选元件两端还含有Cre 重组酶的识别位点（即loxP 位点）。
