低毒高效的植物石蜡切片方法_李凤英
- 格式:pdf
- 大小:1.73 MB
- 文档页数:4
植物组织石蜡切片的制作一、实验目的1.熟练掌握石蜡切片的方法。
2.掌握永久制片的制作过程,为研究植物的内部结构奠定基础。
3.学会植物内部结构的比较研究方法。
二、实验器具与试剂1.器具石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。
2.试剂10%番红水溶液、0.5%固绿(用95%的酒精配制)、酒精(100%、95%、80%、70%、50%)、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。
三、实验材料幼嫩植物各部分,根据季节选择材料。
四、实验内容与方法石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。
它是把材料封埋在石蜡里面,用旋转切片机切片,可以切出很薄的切片。
凡是精细的工结构,大都用石蜡切片。
全都过程如下:1.固定 2.洗涤 3.脱水与硬化 4.脱酒精 2.封埋 6.切片7.粘片 8.脱蜡 9.染色 10.脱水 11. 透明 12.胶封(一)固定1.固定的意义:固定就是用药品把细胞杀死,使细胞的原生质凝固,死后不发生变化,尽可能保持原来的结构以供我们观察。
良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固;不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色。
2.固定液的种类:固定液的种类很多,根据配制成分可划分为:(1) 简单固定液:以一种化学药品配制的固定液。
常用的简单固定液有:A.酒精即乙醇,用作固定液,常用纯酒精或95%酒精。
酒精穿透力强,固定时间常在1小时以内。
高浓度酒精有使材料收缩的作用。
70%的酒精可作保存液。
配制低度酒精必需要用普通酒精即95%的酒精,绝不可用纯酒精。
酒精为还原剂,不能与铬酸、锇酸、重铬酸钾等氧化剂配合。
酒精可使核酸,蛋白质及肝醣等发生沉淀,但能溶解脂肪及拟脂。
B.福尔马林即甲醛,具强烈刺激性的气味,纯净的甲醛,为无色透明液体。
固定用的浓度为4-10%甲醛也是强还原剂。
不能与铬酸、锇酸等氧化剂配合。
经固定后,材料变硬,通常不引起皱缩,但随后经过他种药剂处理时,就每每出现皱缩。
在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前,必须根据植物材料的特性,采用不同的方法,对植物材料进行处理,把材料制成透明的玻片标本.根据材料的性质和制作法的不同,常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类,前者常用的有徒手切片法,冰冻切片法,火棉胶切片法,石蜡切片法,冷冻切片法等,其中以石蜡切片法最为常用.后者包括整体封藏法,涂布法,压片法等.石蜡切片法石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法.石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片.取材用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定. 取材的注意事项如下:(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织;取病理材料时,应设置对照材料.(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm 小段;叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显.(4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行);对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低.(二)固定将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签.良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固;不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色.常用固定液:简单固定液以一种化学药品配制的固定液.⑴乙醇为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇.⑵甲醛为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%.⑶醋酸为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温下凝结成冰,故又名冰醋酸.2. 混合固定液:由几种试剂,适量配制而成.混合遵循原则:①优缺点互补;②膨胀与收缩相互平衡;③强氧化剂与还原剂应分别配置.常用混合固定液有下列几种:⑴ FAA 固定液(福尔马林-冰醋酸-乙醇) 广泛适用于根,茎,叶,花药,子房的组织切片,所以又称为万能固定液.一般固定时间不低于24 h.该固定液优点是在较低温度下(10℃左右)适用于材料的长期保存,可兼作保存液.并且固定的材料,不妨碍染色,但用于细胞学上的固定效果较差.⑵纳瓦兴(Navaschjn's)固定液 1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存;主要用于显示分裂相.(三)抽气植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.一般抽气时间为20-30 min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.(四)洗涤固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶,影响观察;有的还会继续作用,使材料变质等.因此,在使用材料时,需根据固定液的种类,用水,缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液.如:用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次.如用水洗涤,可将材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用纱布将管口扎紧,置于水槽内,进行流水冲洗.流水冲洗时间一般为12-24 h.(五)脱水材料经洗涤后含有部分水分,会使材料分解.而且透明剂与水是不相混合的,不利于材料的透明和包埋等后期处理.因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分,以便让石蜡渗透进细胞.所以,脱水是制片的关键环节.脱水剂要求能与水混合,而且能与其他有机溶剂互相替代.脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行,防止吸收空气中的水分;在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料,以免损坏材料. (六)透明透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质,可以将材料中的脱水剂置换出来,使石蜡能顺利进入材料中.二甲苯是目前应用最广的透明剂,作用迅速,但易使材料变脆..(七)浸蜡是指逐步清除材料中的透明剂,以使石蜡充分渗透于材料内部的过程.这样,材料的各部分都能保持原来的结构与位置,切片不致发生破裂或其他变形.浸蜡是一个渐进的过程,常用的正丁醇.每次浸蜡的时间,视材料大小而调节.(八)包埋材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.(九)切片即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.(十)贴片是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.常用的粘片剂有下列二种:(1) 明胶黏片剂(2) 蛋清黏片剂(十一) 染色即根据植物细胞中不同的化学性质,用染料分别进行染色,以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等.染色基本程序为脱蜡,染色,分色封片.染色方法可分为下列几类:①单染只用一种染料染色.②双重染色两种染料染色,如番红--固绿;苏木精---曙红.③多重染色多种染料染色,如番红—固绿—桔红G;酸性品红—苯胺蓝—桔红G等.(十二) 封藏封藏于中性树胶中,使材料能在显微镜下清晰地显示出来,并能长期保存.方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触,然后再缓慢地放下,避免产生气泡.。
常规石蜡切片制片方法组织经系列酒精的脱水,经透明剂的作用,经熔化的石蜡的浸渍,包埋后所切成的切片称为石蜡切片。
组织脱水把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。
不管是正常的组织,还是有病变的组织,都含有不同程度量的水分。
据测定,人体的物质组成约含水55~67%,蛋白质15~18%,脂类10~15%,无机盐3~4%及糖类1~2%[14]。
如果不把这些水分脱去,石蜡切片将无法进行,因为石蜡和水不能混合在一起,所以除去组织中的水分成为制片中的关键,用什么物质才能担当起这个重任呢,至今为止,国内所用的都是酒精。
因它不管在什么样比例的情况下都能和水混合,所以它可以慢慢地将水从组织中置换出来。
酒精脱水力强,对组织又有硬化和易脆的不良影响。
在使用时,通常是从低浓度至高浓度,浓度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%,组织经过这一系列处理后,基本可达到脱水的目的。
临床上如使用含酒精的固定液固定组织时,(Carnoy氏、AAF液)组织不需要经过低浓度的酒精,可直接进入95%酒精脱水。
组织脱水,目前常用的有两种方法1.人工组织脱水法该法经济实惠,灵活度高,可根据不同的组织及其大小来确定脱水时间,也可根据不同组织及大小分批进行脱水,其优点是:①可根据不同的组织及大小,任意增减脱水时间,达到脱水目的。
②可随时观察组织的变化,随时中断组织的脱水,不使组织过度硬脆。
③可以多层次地进行脱水。
缺点:①需耗费人力,每个步骤的递增都需要人工完成。
②不能大批量的进行脱水。
③必须在上班完成脱水或者定点于某一浓度的酒精中过夜,晚上无法进行梯度递增。
2.自动组织脱水机脱水法自动组织脱水机的机型品种繁多,大小不一,国内生产的轨道式和圆盘式两种,国外生产的有圆盘式和柜式两种,上述国内外四种型号的机子,我们都使用过,根据使用的效果做一简单介绍。
①轨道式自动组织脱水机。
这种机子容量小,脱水用的试剂不足一千毫升,组织块脱水用的提篮小,每次只能容纳40块组织左右,它适合于较小的单位,但不适合于大单位。
低毒高效的植物石蜡切片方法作者:李凤英,马姜明,梁士楚,唐绍清,薛跃规来源:《农学学报》 2014年第4期李凤英,马姜明,梁士楚,唐绍清,薛跃规(广西师范大学生命科学学院/珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室,广西桂林541004)摘要:以乔木、灌木和藤本等不同类型植物叶及部分根茎为试验材料,对石蜡切片的主要技术环节进行了探究和改进。
用天然有机溶剂松节油(oil of turpentine)代替二甲苯(xylene)为透明与脱蜡剂,以阿拉伯树胶(gum acacia powder)为贴片剂,采用番红整体染色与固绿分片染色相结合进行双重染色。
试验结果表明,该方法可避免二甲苯的毒性危害,减少环境污染,缩短试验所需的时间,提高劳动效率和制片质量。
关键词:石蜡切片;植物;低毒高效;方法中图分类号:Q94-336 文献标志码:A 论文编号:2013-07730 引言石蜡切片是植物显微技术上最重要最常用的一种方法,在植物解剖学及其相关领域的生产和科研中有着广泛应用[1]。
尤其是近年来,随着科学技术的发展与植物生态解剖学的兴起,石蜡切片技术重新活跃于植物科学研究领域,并成为了不同生境植物或演替系列优势种生态适应性研究的重要手段[2-4]。
但是,传统的石蜡切片方法不仅耗时长,而其常用的透明剂——二甲苯[1],气味奇臭难闻,是有机合成易挥发的可疑致癌物,毒性较大。
二甲苯能够通过呼吸道和皮肤粘膜进入人体,损害神经和血液系统[5],对制片工作和人体健康构成了潜在的危险。
加上石蜡切片程序复杂、步骤烦琐,不易切出满意的切片。
因而石蜡切片技术的改进一直是学者关注和研究的重要问题之一。
自20世纪50 年代末以来,李正理教授曾多次修订出版了《植物制片学》、《植物制片技术》和《植物组织制片学》,为植物石蜡切片等奠定了技术基础[1]。
近年来,不少学者对植物石蜡切片技术进行了一些有益的探索和改进,如植物制片多重整体染色技术的研究[6]、透明和脱蜡技术的改良[7]、包埋和修蜡过程的改进[8],常规植物石蜡制片技术的改进[9-10],以及蕨类植物石蜡切片制作技术探讨[11]等。
一种针对人体皮肤组织快速、低毒的石蜡切片新方法
王伟;罗源
【期刊名称】《吉林医学》
【年(卷),期】2013(034)030
【摘要】目的:通过对皮肤石蜡切片过程中各步骤的优化,摸索出一个适用于皮肤组织快速、低毒的石蜡切片方法.方法:将250份皮肤标本分为两组,分别采用传统切片法和新型方法进行石蜡切片制作,计算两种方法所用时间;比较甲基环己烷和二甲苯在透明过程和切片染色的效果.结果:传统方法和新型方法制片都需经过12步来完成,新型方法组切片总过程所耗总时间(约7hrs)明显短于传统方法组(约83hrs).结论:采用甲基环己烷替代二甲苯,降低了实验对人员的毒性,且制作出的石蜡切片与传统方法在质量上无明显区别.
【总页数】2页(P6211-6212)
【作者】王伟;罗源
【作者单位】复旦大学生命科学学院,上海,200433;凌科生物科技有限公司,上海,200316
【正文语种】中文
【相关文献】
1.一种制做皮革样化皮肤组织切片的新方法 [J], 程文斌;王健泽
2.一种快速石蜡切片方法与快速冰冻切片方法的比较 [J], 王双珠
3.针对棋盘格角点快速检测的一种新方法 [J], 张铁楠;涂亚庆;王德超
4.一种低毒透明剂制作植物叶片石蜡切片的方法 [J], 李亚男;严炜;罗丽娟;吕玉兰;
黄家雄
5.一种针对人体皮肤组织快速、低毒的石蜡切片新方法 [J], 王伟;罗源
因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。