石蜡切片技术实验(内附组织染色后的照片)

石蜡切片实验报告实验目的，通过石蜡切片实验，观察细胞的形态结构和组织构成，掌握石蜡切片技术的操作方法，提高细胞学实验操作技能。

实验仪器与试剂，显微镜、石蜡切片、染色剂、玻璃片、显微镜载玻片、酒精、甘油、显微镜盖玻片。

实验步骤：1. 取一块石蜡切片，将其放置在玻璃片上，用酒精浸泡片切片5分钟，使其软化。

2. 用刮刀将石蜡切片刮至薄如纸张。

3. 将切好的石蜡切片浸泡在染色剂中，染色10分钟，使细胞染色。

4. 将染色后的石蜡切片放入酒精中脱水，然后放入甘油中固定。

5. 取一个显微镜载玻片，将固定好的石蜡切片放在载玻片上，盖上显微镜盖玻片。

6. 将载玻片放置在显微镜上，调节倍率，观察石蜡切片下的细胞结构。

实验结果与分析：经过显微镜观察，我们发现石蜡切片下的细胞结构清晰可见，细胞核、细胞质、细胞壁等结构清晰可辨。

通过不同染色剂的染色，我们可以清晰地观察到不同细胞器的形态和分布，比如细胞核的形态、染色颜色的深浅等。

此外，我们还可以观察到细胞在不同发育阶段的变化，对于研究细胞生物学和组织学具有重要意义。

实验总结：通过本次石蜡切片实验，我们掌握了石蜡切片技术的操作方法，提高了细胞学实验操作技能。

在实验中，我们需要注意石蜡切片的切割技巧和染色方法，以保证观察到的细胞结构清晰、准确。

在未来的实验中，我们将继续加强对细胞结构和组织构成的观察，不断提高实验操作技能，为细胞生物学和组织学的研究工作做出更多的贡献。

参考文献：1. 高等学校生物学实验教学指导委员会. 生物学实验指导[M]. 北京，高等教育出版社，2003.2. 张三等. 细胞生物学实验指导[M]. 上海，上海科学技术出版社，2005.。

石蜡切片苏木精－伊红（HE）染色方法
（1）选择切片：组织尽量完整，无分裂；
（2）脱蜡：65℃烤片1h，使用二甲苯进行脱蜡，二甲苯Ⅰ-20min（二甲苯先加热到65℃，然后水浴）→二甲苯Ⅱ-15min（常温）；（3）水化：采用乙醇梯度水化，乙醇二甲苯-2min→无水乙醇Ⅰ-2min →无水乙醇Ⅱ-2min→95%-2min→90%-2min→80%-2min→70%-2min→60%-2min；
（4）RO/UP水冲洗一遍（约10s）；
（5）苏木精染色：水化后的切片放入苏木精染液中浸15min，染细胞核。

RO/UP水冲洗1min；
（6）1％盐酸乙醇分化10 s; 弱碱性水溶液（5%氨水溶液）返蓝10s （7）自来水冲洗10分钟；
（8）梯度乙醇脱水：60%-70%-80%-90%，各2min
（9）伊红染色：充分水化后的切片直接入伊红染色液中，染细胞质1min；
（10）梯度乙醇脱水：95%→100%Ⅰ→100%Ⅱ→乙醇二甲苯—二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，各2min；
（11）中性树胶封片，65℃烤片至树胶凝固（3h以上）。

实验时间石蜡切片及染色过程
石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。

苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。

这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。

经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

实验步骤及注意事项
一、石蜡切片
1. 取材: 刀片要求锋利而薄,组织厚度约2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm 为宜. 取材时间越快越好.
2. 固定: 组织取下后应立即放入 10%福尔马林(相当于 4%甲醛)固定.
注意：
(1) 固定液量应为组织块体积的 40 倍.
(2) 固定时间固定时间与使用的固定液种类和组织块大小, 温度等
有关. 一般为 3—24h.
(3) 固定温度大多可在室温固定, 在低温(4℃)时间应延长.
(4) 固定容器应大些.
3. 漂洗: 流水冲洗 2—10h.。

石蜡切片免疫荧光实验步骤
一、样品处理
1、选择适当体积的样品石蜡切片，防止干燥，封好盖子到-80℃，直
到使用时将其取出变性到室温，以备后续操作。

2、室温下取出石蜡切片，施加蛋白酶将切片上原有的细胞、细胞膜
分解，具体操作步骤为：将取出的石蜡切片放入0.1%胰蛋白酶(Protease，Roche)或0.5% Triton X-100溶液中，置于37℃水浴摇床，25min后将石
蜡切片放入3mm×2mm的转移槽内，加入200ul去离子水，搅拌进行超声
处理，30s后用1000ul去离子水冲洗，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。

二、组织切片染色
1、在刻线玻片上放入石蜡切片，用吸水棉柱将石蜡切片固定。

2、用0.1%胰蛋白酶(Protease, Roche)或0.3% Triton X-100溶液
浸泡石蜡切片，置于37℃水浴摇床，15min后去除液体，另用500μl去
离子水洗涤，将含有抗体的抗体溶液稀释至0.3μg/ml，加入石蜡切片上，放入35℃恒温箱，反应1h。

3、取出石蜡切片，加入1000μl去离子水洗涤，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。

三、免疫荧光检测
1、把石蜡切片放入适量的去离子水中浸泡，去除多余的抗体。

2、将放入去离子水中浸泡的石蜡切片放入多孔玻片，在摇床上稀释FITC标记的抗体，加入石蜡切片上，置于37℃水浴摇床上，1h后去除液体。

实验时间石蜡切片免疫组化实验（含详细步骤）
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。

根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

其中前三种最常用。

实验原理
根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔 IgG 分子结合在多聚酶上形成多聚物分子，其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。

实验步骤
1. 石蜡切片置于67 ℃ 烘箱中，烘片 2 小时，脱蜡至水，用 pH 7.4 的 PBS 冲洗三次，每次 3 分钟（3 × 3'）。

2. 取一定量 pH = 6.0 柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理 10 分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用 PBS 冲洗2 × 3'（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）。

实验二十一石蜡切片法（四）——染色、封藏
仪器设备：显微镜
器具：盖玻片、载玻片、滤纸、镊子、吸水纸、剪刀、解剖盘、棕色滴瓶、染色缸、一次性针筒、培养皿。

材料：石蜡切片
试剂及其配置：各级乙醇（50%、70%、85%、95%、100%）、1/2二甲苯+1/2无水乙醇、二甲苯、埃利希氏苏木精染液、0.2%曙红水溶液、中性树胶
附：埃利希氏苏木精配方
苏木精 1克
纯乙醇（或95%乙醇） 50毫升
冰醋酸 5毫升
钾矾（硫酸铝钾）约5克（饱和量）
甘油 50毫升
蒸馏水 50毫升
配法：
①将苏木精溶与约15毫升的纯乙醇中，再加冰醋酸后搅拌。

②当苏木精溶解后即将甘油倒入并摇动容器，同时加入其余的乙醇。

③将钾矾在研钵中研细并加热，然后将它溶解于水中。

④将温热的钾矾溶液一滴一滴地加入上述染液中，并随时搅动。

⑤此液混合完毕，将瓶口用一层纱布包着小块棉花塞起来，放在暗处通风的地方，并经
常摇动以促进它的成熟。

成熟时间约3-4周。

若加入0.2克碘酸钠，可立刻成熟。

此液稳定而染色均匀，染核效果良好，不会发生沉淀，长期储备无妨。

此液可分别与伊红（Enosin 曙红）、橙黄G、番红进行三重染色。

石蜡切片和HE染色石蜡切片& HE染色组织石蜡切片（常规）1、取材：8*6*2mm2、固定：PFA固定过夜（12-24h）3、梯度脱水：50%酒精1h,75%酒精1h(可长期保存)，85%酒精1h，95%酒精1h，100%酒精30min两次。

4、透明：100%酒精+二甲苯（1：1）30-45min，二甲苯ⅰ30min，二甲苯ⅱ30min,观察到透明为止。

5、浸蜡:二甲苯+石蜡（1：1）1h，石蜡ⅰ1h，石蜡ⅱ1h(过夜)。

6、包埋：将组织取出并放入盒内调整好位置，将组织完全平放于盒中，用针头将组织上浸蜡时残留的蜡剔除，使它可以完全被包埋，最后将蜡块于室温慢慢冷却后放入4℃冰箱中保存备用。

7、切片：用刀片将包有组织的蜡块进行修切，切成5-4μm厚的连续薄片，仔细观察薄片中央的组织，取较为完整的组织薄片。

8、展片与烤片：将蜡片黏贴在载玻片上，放于展片机中42℃展片1-2分钟。

最终后放入60℃烤片机中烤片1-2h.9、脱蜡与复水：将切片依次经过二甲苯，两次，各20min。

无水酒精（5min）95%酒精（5min）80%酒精（3min）70%酒精（3min）蒸馏水（5min）。

HE染色1、组织切片脱蜡至蒸馏水2、苏木素染色5min,自来水冲洗3、0.5%盐酸乙醇（0.5ml HCl + 100ml 70%乙醇）分化30s （提插数下）4、自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min5、置伊红液2min6、常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）1min→95％乙醇（Ⅱ）5min→100％乙醇（I）5min→100％乙醇（Ⅱ）5min→二甲苯乙醇（1：1）5min→二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→二甲苯（Ⅲ）5min→中性树脂封固HE染色注意事项：1. 染色时调节pH值很重要。

如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。

因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。