植物石蜡切片的固定与保存

四、实验结果
包埋后的石蜡快应为均匀的半透明状，蜡块中没有 气泡。
包埋材料摆放的位置是否符合要求？
修块效果：每个蜡边与材料平行，蜡边的上下左右摇 平行。
切片效果：得到厚薄均匀的蜡带，蜡带无破损。 展片效果：展片后蜡带或蜡片平整，无气泡、粘附牢 固，蜡带略呈透明状，后续制片不易脱落。
五、作业
实验完毕，每人交包埋块一个，在纸盒上写
上材料名称及自己的姓名和日期；
实验完毕，每人交玻片两张，用铅笔在载玻
片上写上材料名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
苦味酸液（波茵氏液）
甲液： 1％铬酸 10％醋酸 乙液： 甲醛 苦味酸饱和水溶液 50ml 20ml 25ml 75ml
包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊 结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出 薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石 蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡 已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后 二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
实验六 石蜡切片法
—— 包埋、切片和贴片
石蜡切片法
石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法，除了
藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既 可制成较薄的切片，使材料各部分都清晰可见，同时也
可制成连续切片，观察材料的动态发生及层次，所以，
它在显微制片技术中占有非常重要的地位，必须掌握， 同时也是进行透射电镜观察超薄切片的基础。

包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊 结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出 薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石 蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡 已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后 二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
脱水（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（目的？） 脱水时间：视材料的性质、大小而定 小鼠肝脏：在各级AL中停留0.5-1h； 植物叶片：在各级AL中停留2-4h； 注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水；如需过夜， 则停留在70%酒精中。
二、实验步骤（2）
透明（置换） 常用透明剂：二甲苯； 透明原则：低浓度到高浓度 （½ 二甲苯+ ½ 100%酒精 二甲苯 二甲苯） 透明时间：小鼠肝脏每级停留0.5-1h；植物叶片每级停留1-3h。
染色原理－－化学作用
化学作用的主要理论根据是染色剂的性质可分为酸性、碱性和 中性染色剂，而动、植物的细胞内—般也可区分为酸性(阴离子) 和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳 离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸 性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳 离子(碱性部分)较牢固地结合。 例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸 性的组成成分．故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于 着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(伊红、曙红)的亲 和力很大，易于着色。
甲醛－醋酸－酒精液(FAA) 50%或70％酒精 90ml 冰醋酸 5ml 甲醛 5ml 特点：过去称”标准固定液“或”万能固定液“；是 组织形态中常用的固定液；同时兼作保存液。是植物 制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和 丝状藻类外，均可用此液固定．也通用于昆虫和甲壳 类的固定。

石蜡切片免疫组化操作步骤1.组织固定：首先，将需要观察的组织或细胞固定在福尔马林或4%的乙醛溶液中。

固定时间取决于样品的大小和类型，常见的固定时间为12-24小时。

2.组织处理：将固定的组织或细胞进行脱水和清洁处理，以使其能够被石蜡包埋。

常见的脱水方法是使用乙醇系列浓度逐渐提高，如70%乙醇、95%乙醇和绝对乙醇。

然后，将样品浸泡在透明剂（如苯并并酮或二甲苯）中，使其透明。

3.石蜡包埋：将透明的组织或细胞浸入熔化的石蜡中，使其完全包裹。

常见的石蜡温度为55-60摄氏度。

可以使用芯片或模具来定制大小合适的石蜡块。

4.组织切片：使用医学切片机或超微切片机，将石蜡块切割成薄片。

通常，切割厚度为4-6微米，但也可以根据需要进行调整。

5.切片脱蜡：将切好的石蜡切片放置在热盖玻片上，用热蜡表面接触面向下。

然后，将玻璃片放入组织脱蜡盒中，加热至60-70摄氏度，使石蜡脱离切片，另外，该步骤还可以利用草酸进行加速。

6.抗原解封：使用溶液（如柠檬酸缓冲溶液或EDTA缓冲溶液），将切片置于高温下进行抗原解封。

温度和时间因需求而异，通常在95-100摄氏度下进行10-30分钟。

解封后，冷却切片，并在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行冲洗。

7.抗体处理：在切片上添加特异性的一抗体，与目标分子结合。

一抗体可与多种分子结合，如细胞表面蛋白、核蛋白等。

放置于4摄氏度下冷藏过夜，或者进行适当的孵育时间。

9.检测和显色：在切片上使用适当的检测或显色方法，观察特定分子的存在和分布。

常见的方法有荧光显微镜、透射电镜、酶标法等。

不同的检测方法需要不同的荧光染料、显色剂或底物。

10.封片和保存：将切片用适当的介质（如甘油/PBS缓冲液）覆盖，以保持切片的湿度和保存状态。

然后，用封片胶或透明胶带将切片封闭，并在干燥避光条件下保存。

总结起来，石蜡切片免疫组化的操作步骤包括组织固定、组织处理、石蜡包埋、组织切片、切片脱蜡、抗原解封、抗体处理、二抗处理、检测和显色，以及封片和保存。

态等方面是最为理想的制片方法。广泛用于医院、 医科院校、生物医学研究机构、农科、畜牧兽医 等动植物组织研究，尤其在病理学方面是诊断疾 病的重要工具之一。
石蜡切片的主要步骤： 一、取材 三、洗涤 五、透明 二、固定 四、脱水 六、透蜡与包埋
七、切片
九、染色
八、贴片
十、封藏
一、实验原理： 1、取材
指从人体或实验动物体内取下所需观察的组织 材料的过程。 材料的选择是制作切片的第一步。 用于制片的动、植物材料应选择新鲜的，用陈腐 的材料制片往往不能反映材料的真正情况。
⑤ 固定材料的容器应注明固定液、材料来源、日
期、操作者签名等，以免与其他材料混淆。
⑥ 任何固定液对人体都有损害作用，因此固定液
的容器必须密闭，以防挥发损伤器官和眼睛，
忌用手与固定剂直接接触，以免损伤皮肤。
三、常用固定液的种类
（一）单一固定液 1、酒精（C2H5OH）：无色液体，可与水任意比例 混合，是一种还原剂，不可随意与重铬酸钾、铬 酸、锇酸等混合。酒精渗透力很强，易引起组织 收缩，固定用的适宜浓度一般为70％。
3醋酸冰醋酸ch3cooh4苦味酸三硝基苯酚c6h2no23oh5重铬酸钾k2cr2076铬酸三氧化铬水溶液h2cro47四氧化锇锇酸oso48氯化汞升汞或二氯化汞hgcl2二混合固定液1卡诺carrnoy氏固定液2faa固定液醋酸酒精福尔马林混合液3波恩bouin氏固定液4秦克zenker氏固定液5纳瓦兴nawashin氏固定液四实验步骤1动物取材
2、甲醛（HCHO）：无色气体，易挥发，具有强烈 的刺激性气味，37～40％的水溶液称为福尔马林。 甲醛也是一种强的还原剂，不可与铬酸、重铬酸 钾、四氧化锇等氧化剂混合。穿透力虽不如酒精， 但不会象酒精那样引起组织强烈收缩，两者混合 使用效果更好。常用于固定和保存标本的福尔马 林浓度为5～10％。