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恩诺沙星残留对土壤中反硝化细菌氧化二氮还原酶基因(nosZ)多样性的影响马驿;陈杖榴【摘要】为了解恩诺沙星在环境中残留对土壤微生物的影响,通过PCR扩增、基因克隆、RFLP分析法对恩诺沙星影响下的土壤反硝化细菌氧化二氮还原酶nosZ基因的分子多样性进行了研究.结果表明,恩诺沙星作用于土壤后第35天,Ⅰ-Ⅵ组(Ⅰ组0μg/g、Ⅱ组0.01μg/g、Ⅲ组0.1μg/g、Ⅳ组1μg/g、Ⅴ组10μg/g、Ⅵ组50μg/g)的OTUs与克隆子的百分比分别为:48.30%、41.88%、34.78%、33.62%、25.42%、23.81%;第70天,Ⅰ-Ⅵ组的OTUs与克隆子的百分比分别为:29.66%、24.24%、18.10%、16.67%、15.83%、14.39%.对照组多样性指数均高于添加药物组,第35天,对照组的Margalef指数与添加药物各组差异均显著(P<0.05),第70天,仅与10μg/g和50μg/g两组差异显著;第35天,除了0.01μg/g 组,对照组的Shannon-Wiener指数与其他添加药物组差异均显著,第70天,仅与50μg/g组差异显著.由此可见,随着药物作用的时间延长,药物含量0.01-10μg/g组土壤反硝化细菌的多样性与对照组之间的差异变小.【期刊名称】《生态学报》【年(卷),期】2010(030)004【总页数】7页(P1011-1017)【关键词】恩诺沙星;土壤微生物多样性;反硝化细菌;RFLP【作者】马驿;陈杖榴【作者单位】华南农业大学,广东省兽药研制与安全评价重点实验室,广州510642;广东海洋大学动物医学系,湛江524088;华南农业大学,广东省兽药研制与安全评价重点实验室,广州510642【正文语种】中文恩诺沙星(enrofloxacin)作为动物专用抗菌药，已广泛用于动物感染性疾病的治疗。
兽药进入动物机体后，不仅会在畜禽产品中残留，并且药物将以原形化合物和代谢产物的方式经粪、尿等排泄物进入生态环境，污染土壤、表层水体等，并通过食物链影响植物、动物和微生物的正常生命活动，最终将影响人类的健康[1- 2]，恩诺沙星对植物和土壤微生物等的影响已有报道[3- 4]。
抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的测定实验目的：通过采用常量稀释法, 检测几种抗菌药物对A8、A9、D5菌株的最小抑菌浓度( MIC) , 对临床诊断用药有指导作用。
【试剂与器材】1.试剂⑴主要仪器设备：三角烧瓶、高压灭菌器、内径90mm平皿、试管、0.5麦氏标准比浊管、天平、接种环、吸头、微量加样器、胶布、分光光度计、酒精灯等。
⑵试验药品：培养基基础粉（酸水解酪蛋白/酸水解酪素、牛肉浸膏粉、淀粉、琼脂）、纯水（蒸馏水）、电炉、牛皮纸、线、抗菌药物、无菌生理盐水、蒸馏水、pH6.0 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液。
⑶试验菌株：A8、A9、D5菌株、标准株大肠杆菌。
在肉汤或琼脂中将抗菌药物进行一系列（对倍）稀释后定量接种待检菌，35℃孵育一定时间后，观察抑制待检菌肉眼可见生长的最低药物浓度，即为该药物对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）。
【试验方法】肉汤稀释法试管稀释法（常量稀释法）【原理】用MH肉汤将抗菌药物作不同浓度的稀释，再接种待检菌，定量测定抗菌药物抑制或杀灭待检菌的最低抑菌浓度（MIC）。
【操作步骤】①抗菌药物原液制备：配制抗菌药物原液的溶剂和稀释剂大多采用蒸馏水、pH6.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液等。
抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
公式为：质量（mg）=溶剂（ml）x浓度（μg/mg）/分析效能（μg/ mg）表1 稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法②药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
表2常用药敏纸片试验方法：1.用记号笔在培养基上标记待检菌名。
2.在已分纯的待检菌培养基上取4个～5个菌落，接种在4ml～5ml水解酪蛋白（MH）肉汤中，置35℃培养4h～6h，链球菌、嗜血杆菌等需用加血的肉汤增菌并孵育过夜。
优化高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留情况-食品安全论文-社会学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——诺氟沙星(NOＲ)、恩诺沙星(ENＲ)、环丙沙星(CIP)、达氟沙星(DAN)和沙拉沙星(SAＲ)为常见的氟喹诺酮类抗菌剂，目前在畜禽生产中被广泛应用．此类药物使用不当导致的药物残留可能直接危害人体健康，也可能使致病菌产生耐药性，间接对人类健康造成影响．多个国家和地区均规定了氟喹诺酮类药物的最高残留限量．检测动物源食品中氟喹诺酮类药物残留的方法有微生物法、酶联免疫法(ELISA)、毛细管区带电泳法、电解分析法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱－质谱联用法(HPLC-MS)等．目前，在鸡肉产品的检测中，常采用的方法是《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测－高效液相色谱法》(农业部1025 号公告14-2008)．本试验以此标准为基础，简化了试验前处理方法，优化了检测过程．经试验验证，该法非常适合大批量处理样品，大量节省了处理时间和所需耗材，较大幅度降低成本，方法的灵敏度和回收率均可满足我国现行兽药残留检测分析的要求．1 材料与方法1．1 药品和试剂恩诺沙星对照品、环丙沙星对照品、诺氟沙星对照品、达氟沙星对照品、沙拉沙星对照品，均为中国兽医药品监察所产品，磷酸二氢钾、磷酸、三乙胺、氢氧化钠溶液(分析纯，广州试剂厂)，乙腈(色谱纯，Fisher 公司)．1．2 仪器和设备Agilent 高效液相色谱仪( 美国Agilent 公司) 配荧光检测器，高速匀质机及振荡器(德国IKA 公司)，高速台式冷冻离心机(美国Thermo 公司)．1．3 试液配制分别称取恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星对照品各10 mg，置于同一个10 mL 容量瓶中，用0.05 molL－1的氢氧化钠溶液溶解定容至刻度，制得质量浓度均为1 mgmL－1的混合储备溶液．准确称取达氟沙星对照品10 mg，0. 05 molL－1的氢氧化钠溶液溶解定容至10 mL，使其质量浓度为1 mgmL－1．准确称取沙拉沙星对照品10 mg，0. 05 molL－1的氢氧化钠溶液溶解定容至10 mL，使其质量浓度为1 mgmL－1．置2 ～8 ℃冰箱中保存备用，有效期1 个月．取上述恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的混和储备液100 L，达氟沙星储备液20 L，沙拉沙星储备液200 L，置于同一个100 mL 容量瓶中，用流动相定容至刻度，配置成恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的质量浓度为1 gmL－1，达氟沙星质量浓度为0. 2 gmL－1，沙拉沙星质量浓度为2gmL－1的混合标准溶液．提取液:称取 2 g 三氯乙酸于容量瓶中，加水至100 mL，制得的三氯乙酸溶液与乙腈按体积比3 ℃ 1的比例混合，搅拌均匀，得到提取液．磷酸/三乙胺溶液:取磷酸3. 4 mL，用水稀释至1 000 mL，配成0. 02 molL－1的磷酸溶液，用三乙胺调pH 至2. 4．临用配制(易产生沉淀)．1．4 测定方法1．4．1 供试材料的制备将市售的鸡肉样品用高速匀浆机绞碎得到供试试料，将空白鸡肉样品绞碎得到空白试料，在空白试料中添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料．1．4．2 提取与净化称取1 g 试料，置于匀浆杯中，加提取液4 mL，高速匀浆1 min．匀浆液转入15 mL聚丙烯离心管中，振荡30 min，16 000 r/min，离心8min，取上清液过0. 2 m 滤膜，装入进样瓶，待测．1．4． 3 色谱条件色谱柱:Agilent TC-C18250 mm 4. 6 mm(i．d)，粒径5m．流动相:V(0. 02 mol L－1磷酸/三乙胺溶液) ℃ V (乙腈) = 80 ℃ 20．流速:1mLmin－1．检测波长:激发波长280 nm ;发射波长450 nm．进样量:20 L．1．5 线性范围与检出限空白样品中加入混合标准液配制成的诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星系列标准溶液．高效液相色谱仪检测后，以峰面积为纵坐标，药物质量浓度为横坐标，进行线性回归分析．在空白样品中添加不同质量浓度混合标准溶液，按1. 4的方法进行处理，检测后取信噪比S/N = 3 对应的样品浓度为方法检出限(LOD)，信噪比S/N =10 对应的样品浓度为方法定量限(LOQ)．1．6 回收率和精密度向空白待测样品中分别添加3 个浓度水平的混合标准液，按1. 4的方法进行处理，每个浓度重复5 次，连续做3 个批次，计算回收率和变异系数．2 结果与分析2．1 色谱分析在试验选定的条件下，测得诺氟沙星的保留时间为6. 67 min，环丙沙星为7. 19 min，达氟沙星为8. 18 min，恩诺沙星为9. 07 min，沙拉沙星为12. 93min，峰形尖锐，分离完全，空白组织样品在上述保留时间无干扰峰出现(图1)．2．2 方法的检出限及标准曲线空白鸡肉样品中添加不同质量浓度的标准工作溶液，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留定量限为10 g kg－1，达氟沙星的残留定量限为2gkg－1，沙拉沙星的残留定量限为20gkg－1．诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的线性范围为10 ～100 gkg －1，达氟沙星为 2 ～20gkg－1，沙拉沙星为20 ～200 gkg－1．对质量浓度不同的混合标准使用液进行色谱分析，工作曲线的线性范围、回归方程、相关系数见表1．可见，本方法灵敏度高、线性范围较宽，有一定的实用价值．【表1】2．3 方法的回收率与精密度对鸡肉样品分别进行4 个浓度的添加试验，测得的回收率为84.71% ～99.66%，批内变异系数为0．20% ～4. 42% ，批间变异系数为0. 33% ～2. 68% (表2)．2．4 抽样检测从市场上购买30 个鸡肉样品，每份样品2 个重复，按本方法进行制样和检测，结果发现一例鸡肉样品中诺氟沙星残留量为43.5 gkg－1，平行样品中诺氟沙星的质量浓度为41. 4 gkg－1，其余样品均未检出氟喹诺酮药物的残留．表明该方法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量的重现性非常好，相对偏差保持在3%之内，数据可靠．3 讨论与结论3．1 样品前处理方法的优化动物源食品中基质干扰复杂，富含脂肪和蛋白质，选择并优化样品的前处理方法对结果的准确性尤为重要．本试验在农业部1025 号公告-14-2008 所采用方法的基础上，对样品的前处理过程进行了一定的优化．该标准检测方法采用磷酸盐缓冲液提取完后，离心取上清液，过固相萃取柱，从而除去样品中的杂质．本试验的提取液由乙腈与质量分数为2% 的三氯乙酸按体积比1℃ 3 混合而配得，蛋白质在酸性条件下变性，离心出沉淀除掉杂质，而提取液中加入乙腈也与流动相中乙腈比例吻合，出峰较好．比较其他相关研究，仲锋在鸡组织中检测氟喹诺酮类药物残留量的回收率为70% ～107%，变异系数小于10%;陈红等在鸡排泄物中检测氟喹诺酮类药物的回收率为75% 以上，批内变异系数在2. 2% ～10% 之间，批间变异系数在 6. 2% ～13. 0%之间;而本试验测得的回收率为84. 71% ～99. 66%，批内变异系数为0. 20% ～4. 42%，批间变异系数为0. 33% ～2. 68% ．相较而言，本试验的回收率有了明显稳定的提高，精密度和准确度也相应改善了，定量限能满足日常采集样品的检测范围，而且检测的效率增加，节省了柱子的成本，减少了处理的时间，非常适用于样本量较大时的残留检测．3．2 检测方法的稳定性将新鲜配制的混合标准工作液50 gkg－1于4℃ 冰箱中避光保存1、3、5、7 d 后上机检测，结果表明，被测药物保留时间基本不变，但浓度明显降低，可见标液在保存过程中不稳定，因此在测定过程中应该做到现用现配，处理完后的样品也应及时上机．3．3 结论本试验在农业部1025 号公告-14-2008 所采用方法的基础上，对样品的前处理过程进行了优化，使样品处理快捷便利，灵敏度高，重现性好，明显降低批量样品的检测成本，可有效应用于鸡肉食品品质的日常监控．参考文献:［1］李俊锁，邱月明，王超．兽药残留分析［M］．上海:上海科学技术出版社，2002: 365-390．［2］WINTEＲＲW，KELLY J X，SMILKSTEIN M J．Antima-larial quinolones: Synthesis，potency，and mechanisticstudies［J］．Exp Parasitol，2008，118(4) :487-497．［3］朱蓓蕾．动物性食品药物残留［M ］．上海: 上海科学技术出版社，1994: 115．。
2.5%恩诺沙星溶液标准以下是一份2.5%恩诺沙星溶液的标准文档，包括制备方法、质量标准和注意事项。
**2.5%恩诺沙星溶液标准****1. 制备方法：**取适量纯净水于容器中，称取恩诺沙星25克，溶解于纯净水中。
搅拌均匀后，即可得到2.5%恩诺沙星溶液。
**2. 质量标准：*** 外观：无色透明液体。
* 恩诺沙星含量：不少于2.5%（以重量计）。
* pH值：6.0-8.0。
* 无菌：经无菌检查，应无任何微生物生长。
**3. 注意事项：*** 该溶液应储存于阴凉、干燥处，避免阳光直射。
* 使用前应检查溶液是否澄清，如有浑浊或沉淀，不得使用。
* 该溶液为外用溶液，不得内服。
如不慎溅入眼内或与皮肤接触，应立即用大量清水冲洗。
* 对恩诺沙星过敏者禁用。
* 孕妇及哺乳期妇女慎用。
* 儿童应在成人监护下使用。
* 如出现皮肤刺激、红肿等症状，应立即停止使用并咨询医生。
* 该溶液应在开封后一个月内用完，过期不得使用。
* 药品应在有效期内使用，过期不得使用。
**4. 有效期：**本产品在2-8℃下可保存6个月。
为确保溶液质量，建议在开封后一个月内使用。
**5. 运输与包装：**本产品采用250ml的玻璃或塑料瓶进行包装，每瓶2.5%的恩诺沙星溶液。
在运输过程中，应确保容器密封，防止破损和污染。
**6. 生产日期与批号：**产品的生产日期和批号在产品标签上标明，消费者可依据此信息追溯产品的生产和使用情况。
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同时，所有涉及药品生产和使用的操作，都应符合国家相关法律法规的规定。
恩诺沙星残留对土壤微生物数量及群落功能多样性的影响王加龙;刘坚真;陈杖榴;陈林
【期刊名称】《应用与环境生物学报》
【年(卷),期】2005(11)1
【摘要】对不同浓度恩诺沙星作用于土壤后三大类微生物数量及群落功能多样性进行了研究. 结果表明,恩诺沙星残留对它们影响强弱顺序为:细菌>放线菌>真菌,其影响作用随浓度从每克土0.01 μg至10 μg的增加而加大,药物作用活性维持期为6～8 d,但对真菌作用不明显. 相对较低浓度的恩诺沙星残留(每克土中0.1 μg,1 μg)不影响土壤微生物群落功能多样性,而相对较高浓度的恩诺沙星残留(每克土中10 μg)则降低了其微生物群落功能多样性. 图2 表2
【总页数】4页(P86-89)
【关键词】恩诺沙星残留;土壤微生物;数量;群落多样性
【作者】王加龙;刘坚真;陈杖榴;陈林
【作者单位】华南农业大学食品学院;华南农业大学动物医学院
【正文语种】中文
【中图分类】X171;S154
【相关文献】
1.恩诺沙星对土壤微生物群落代谢功能多样性的影响 [J], 马驿;陈杖榴
2.恩诺沙星残留对土壤中固氮细菌固氮基因(nifH)多样性的影响 [J], 马驿;陈杖榴
3.恩诺沙星对土壤微生物群落功能多样性的影响 [J], 马驿;陈杖榴;曾振灵
4.恩诺沙星残留对土壤微生物功能的影响 [J], 王加龙;刘坚真;陈杖榴;邝永彬
5.残留剂量恩诺沙星对SPF小鼠肠道菌群数量和多样性的影响研究 [J], 贺永亮;雷艳;袁静;唐欢;魏泓
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1环境中的抗生素1.1抗生素的存在现状抗生素指的是由微生物产生或者是化学合成的具有抗病原体或其它生物活性的一类物质，主要有四环素类、喹诺酮类、大环内酯类、氯霉素类等。
而环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）是人工合成使用最为广泛的喹诺酮类抗生素，是恩诺沙星的代谢产物，对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌都具有广谱抗菌性。
它通过抑制DNA旋转酶和拓扑异构酶来阻止细胞分裂，已被证明具有基因毒性。
抗生素广泛地应用于医疗、畜牧养殖及农业生产。
据估计全球每年使用的抗生素达100000到200000吨，而中国每年的使用量超过22000吨，其中超过70%是以药物原形随粪尿排出而进入污水处理系统或直接进入环境。
在农业生产中，粪便常被用作肥料，粪便中的抗生素会渗出进入土壤及底下水，极大地威胁到农产品的安全，如珠三角地区农场土壤及蔬菜被普遍检出抗生素，含量高达1537.4μg·kg-1，而每份土壤及蔬菜样品中环丙沙星都被检出，浓度范围为5.3-119.8μg·kg-1，这些农场都普遍使用粪肥[1,2]，由此可见粪肥的使用是导致农场被抗生素污染的重要原因之一。
在水环境系统的试验中，大多数化合物都是持久性的，只有少数才是可生物降解的。
有基因毒性的化合物如喹诺酮类和甲硝唑类并不能够被去除，喹诺酮类抗生素会强烈吸附到污泥、土壤和沉积物当中而不被生物降解。
此外，由于污水处理系统对抗生素的去除率低于50%，污水厂出水中仍然含有高浓度的抗生素，这些抗生素未能在污水处理过程或环境中降解或消除，它们将进入到地表水或地下水甚至是饮用水中，直接威胁到人身安全。
由此可见，施用粪肥和废水排放是导致农业土壤污染的主要途径。
图1环境中抗生素的来源及其在环境中的可能的转移途径[3] 1.2环境中抗生素的危害及迁移近年来，环境中不断被发现的抗生素引起了人们的极大关注，一方面是由于它潜在的生态风险如对环境中微生物参与的关键进程具有潜在的负面影响，如养分的再生、碳氮循环以及污染物的降解等过程。
生态环境 2005, 14(5): 645-649 Ecology and Environment E-mail: editor@基金项目：国家自然科学基金重点项目（31031040）作者简介：吴银宝（1973－），男，讲师，博士，研究方向为家畜生态学。
E-mail: wuyinbao@ 收稿日期：2005-07-15土壤对恩诺沙星的吸附和解吸特性研究吴银宝1，汪植三1，廖新俤1，陈杖榴21. 华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642；2. 广东省兽药研制与安全评价重点实验室，广东 广州 510642摘要：恩诺沙星是第一个动物专用的氟喹诺酮类药物，在畜禽养殖业中应用非常广泛。
恩诺沙星进入畜禽体后，其原形及活性代谢物会随畜禽的排泄物进入环境，对环境生物产生影响。
文章研究了恩诺沙星在土壤中的吸附和解吸规律，为恩诺沙星的生态风险评价提供依据。
试验分3组，各组土壤分别采自菜园、水稻田和果园。
在离心管中称取1 g 土壤样品，加入恩诺沙星系列标准溶液，在25±0.5 ℃条件下机械振摇，用高效液相色谱（HPLC ）法测定水相中恩诺沙星的含量，分别求出土壤对恩诺沙星的吸附和解吸平衡时间及其对恩诺沙星的吸附和解吸量。
结果表明，土壤对恩诺沙星的吸附和解吸平衡时间分别为34 h 和44 h ；土壤对恩诺沙星的吸附性很强，对恩诺沙星的吸附量占水相中恩诺沙星总量99%以上，其吸附机理符合Freundlich 平衡吸附方程w S =k f ρe 1/n；土壤对恩诺沙星的解吸具有浓度依赖性，其解吸量仅为吸附量的1‰左右，表明恩诺沙星在土壤中的迁移能力弱，不易污染地下水。
关键词：恩诺沙星；土壤；吸附；解吸中图分类号：X131.3 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2005）05-0645-05化合物的环境行为主要指化合物从排放源进入到环境、在环境中数量和浓度分布的时空变化及其在环境中的迁移、转化、降解和富集等行为。
诺氟沙星对土壤细菌数量及耐药性影响
马驿;冯宝顺;李健;卢国栋;彭金菊
【期刊名称】《中兽医医药杂志》
【年(卷),期】2012(31)1
【摘要】为了解诺氟沙星在环境中残留对土壤细菌的影响,在诺氟沙星作用于土壤后第35天对纯培养法分离的土壤细菌进行计数,并对土壤细菌进行抗菌药物敏感性试验。
结果表明,添加药物组的细菌总数均低于对照组,且药物浓度越高,细菌数量越少;在供试的20种抗菌药中,诺氟沙星敏感菌对其中18种药物的敏感性与诺氟沙星耐药菌差异不显著(P>0.05)。
【总页数】4页(P9-12)
【关键词】诺氟沙星;残留;耐药性;土壤细菌
【作者】马驿;冯宝顺;李健;卢国栋;彭金菊
【作者单位】广东海洋大学动物医学系
【正文语种】中文
【中图分类】S859.7
【相关文献】
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2.根际促生细菌(PGPR)对冬枣根际土壤微生物数量及细菌多样性影响 [J], 刘方春;邢尚军;马海林;丁延芹;陈波;杜秉海
3.环丙沙星残留对土壤细菌数量及耐药性的影响 [J], 彭金菊;卢国栋;李健;冯宝顺;马驿
4.O3浓度升高对麦田土壤氨氧化细菌、氨氧化古菌和硝化细菌数量的影响 [J], 伍文;黄益宗;李明顺;于方明;钟敏;隋立华;郝晓伟
5.恩诺沙星对土壤细菌数量及耐药性的影响 [J], 马驿;陈杖榴
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