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表达人骨形成蛋白4的非复制型腺病毒的构建与鉴定

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METRNL的生物学功能及病理生理意义综述

METRNL的生物学功能及病理生理意义综述

METRNL的生物学功能及病理生理意义综述摘要：神经胶质细胞分化调节因子样因子(Meteorin-like, METRNL) 在骨骼肌中大量表达, 是新发现的肌肉因子。

研究发现运动和温度变化等生理性因素参与了METRNL表达的调节。

在脂肪组织, METRNL激活M2型巨噬细胞, 诱导脂肪组织产热增加, 促进能量消耗;此外还在骨生成、脂肪细胞分化和增殖、免疫应答等过程中发挥重要的生物学作用。

METRNL 表达在肥胖, II型糖尿病以及皮肤病等疾病的发生、发展中明显改变, 参与其病理生理调节。

本文将着重对其生物学功能及病理生理意义进行综述。

关键词：肌肉因子; Meteorin-like; 巨噬细胞替代激活;众所周知，骨骼肌是人体最大的内分泌器官，合成和分泌多种肌肉因子，广泛的参与机体的多种生理和病理生理过程。

神经胶质细胞分化调节因子样因子(Meteorin-like, METRNL) 是新发现的肌肉因子，研究表明其具有丰富的生物学功能。

Meteorin是2004年Nishino等人在全反式维甲酸(retinoic acid, RA) 孵育的小鼠胚胎细胞p19中发现一个新的、可分泌的神经生长因子。

Meteorin来源于英文单词流星"meteor";，因为这种物质可以使神经胶质细胞像流星一样延伸出长长的突触"尾巴";，因此得名。

它在神经胶质细胞分化和诱导轴突延长中有重要作用。

由于METRNL与Meteorin在蛋白序列有4 0%的同源性，因而被命名为Meteorin样因子。

早在2007年，北京协和医院宫伟雁在其博士毕业论文对METRNL首次进行了报道。

但直到2014年，哈佛医学院Spiegelman实验室在《Cell》上报道运动诱导骨骼肌合成和分泌METRNL，并发现其在抑制脂肪组织炎症、促进脂肪褐色化中发挥重要作用，METRNL才真正引起人们的广泛关注，大量研究发现METRNL在骨和脂肪组织增殖、分化，外皮黏膜组织炎症及代谢调节中都有着重要的作用。

人脂联素基因重组腺病毒的构建与鉴定

人脂联素基因重组腺病毒的构建与鉴定

人脂联素基因重组腺病毒的构建与鉴定李丙蓉;郑宏庭;邓华聪;郑丹;刘金波;兰丽珍;程伟【期刊名称】《重庆医科大学学报》【年(卷),期】2010(35)11【摘要】目的:构建含有人脂联素基因apM1的重组腺病毒载体,制备能表达人脂联素蛋白的重组腺病毒,为脂联素用于体内外干预动脉粥样硬化奠定基础。

方法:自质粒pGEM-T-apM1上扩增两端带有SalⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的全长apM1基因,将PCR产物和穿梭质粒pShuttle-CMV经SalⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,连接、转化、筛选,进行PCR鉴定后送双向测序。

将鉴定正确的重组质粒pShuttle-CMV-apM1用PmeⅠ酶切使其线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转BJ5183菌,进行细菌内同源重组,筛选、鉴定、扩增,PacⅠ酶切后用LipofectamineTM2000转染低代数的HEK293包装细胞,进行包装出毒。

结果:重组穿梭质粒pShuttle-CMV-apM1经PCR和测序鉴定正确,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,转染293细胞进行包装,产生的病毒经鉴定正确,并且无具有复制能力的腺病毒存在,生物安全性高。

结论:成功的制备了apM1基因重组腺病毒,可进一步用于脂联素干预动脉粥样硬化的研究。

【总页数】5页(P1676-1680)【关键词】apM1基因;腺病毒;同源重组【作者】李丙蓉;郑宏庭;邓华聪;郑丹;刘金波;兰丽珍;程伟【作者单位】重庆医科大学附属第一医院内分泌科【正文语种】中文【中图分类】Q781【相关文献】1.人脂联素基因重组腺病毒对内皮细胞MCP-1和ICAM-1表达的影响 [J], 王桂杰;冷吉燕;卢新卫;张婧;葛媛媛2.人白细胞介素32γ基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 李松林;朱妍妍;李霏;尹元琴3.人脂联素基因重组腺病毒对内皮细胞丙二醛和超氧化物歧化酶水平的影响 [J], 李丙蓉;郑丹;邓华聪;兰丽珍;郑宏庭4.携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达 [J], 陈闽;何姜;刘小莺;黄敬泽;王林曦;刘礼斌5.人神经菌毛素-1基因重组腺病毒的构建及鉴定 [J], 郑见宝;耿智敏;陈强;王林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

病毒转基因技术原理 腺相关病毒

病毒转基因技术原理 腺相关病毒
―采用重组杆状病毒表达系统 BEVSbaculovirusexpressionve ctorsystem,提供三种成分并感 染昆虫细胞或利用包含cap和 rep的稳定包装昆虫细胞系； ―包含cap和rep的稳定包装哺 乳动物细胞系,并通过感染AdV 提供辅助功能； ―利用哺乳动物细胞系和重组 HSV-1提供cap和rep,rAAV和辅 助功能,
病毒转基因技术原理腺相关病毒
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第一节腺相关病毒简介
l生物学特性 l致病性与免疫性
第一部分生物学特性
l血清型 l病毒结构 l病毒复制 l对理化因素的抵抗力
血清型
lAAV是从腺病毒的污染物1965年、人群或非人灵长类动物等 的组织中分离鉴定到的, l共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株variants， l通过签名PCRsignaturePCR技术,利用高度保守序列扩增Cap 基因的一小段可变区的DNA序列,以筛检是否是新的AAV分离 株,然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或和Rep基 因的全长序列，在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵 羊、山羊和蛇等的不同组织器官,发现了大量的具有多样性的 AAV的基因组，但新分离的病毒株,尚未进行血清学分型,通称 为变株， lAAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守,与AAV-2 型较为类似,不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异， 50~80%AAV-2抗体在人群中检测出，
第二节腺相关病毒载体 转基因技术原理
l蛋白表达型腺相关病毒载体
―三成分包装系统 ―自我互补型AAV载体self-complementaryAAVvector,scAAV l基―因打反靶式型剪腺接相型关A病AV毒载载体体trans-splicingAAVvector,tsAAV lrA―AV衣的壳纯蛋化和白定修量饰型AAV载体

大鼠骨桥蛋白重组腺病毒的构建及体外表达

大鼠骨桥蛋白重组腺病毒的构建及体外表达

大鼠骨桥蛋白重组腺病毒的构建及体外表达刘安娜;王佐林【摘要】目的:构建表达大鼠骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因的重组腺病毒载体,并观察其感染人胚肾293AD(human embryo kidney 293AD,HEK293AD)细胞后OPN的表达.方法:提取大鼠骨组织总RNA,利用反转录聚合酶链式反应(reversal transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增目的片段,将产物双酶切后连入腺病毒穿棱质粒载体中,构建pacAd5 CMV-IRES-GFP-OPN.PCR及双酶切鉴定正确后,与腺病毒骨架载体pacAd5 9.2-100同时经Pacl酶切,利用HEK293AD细胞进行包装、生产,构建出重组腺病毒.通过HEK293AD细胞绿色荧光表达反映重组腺病毒的表达情况,并用RT-PCR检测OPN的表达.结果:成功构建了携带OPN 的重组质粒,脂质体介导下转染HEK293AD细胞,7d后可见明显的荧光表达,12d后有半数细胞飘起,收集原病毒液感染的293AD 细胞后,实验组OPN的表达明显高于对照组细胞,24h感染效率为15％,36 h感染效率为21％.结论:利用腺病毒载体系统RAPAD成功构建了含OPN基因的重组腺病毒载体,为进一步研究OPN对皮肤创口愈合的影响提供了一定的实验基础.%Objective: The study was designed to construct a reeombinanl adenovims vector containing rat osteopontin (OPN) by RAPAD vector, and to study its expression in human embryonic kidney 293AD (HKK293AD) cells. Methods: The OPN cDNA was obtained by RT-PCR amplification from rat bone tissue, and then inserted into pacAf]5 CMV-IRES-CFP shuttle vector. The plasmid was checked and verified by digestion and UNA sequence analysis, then it and pacAd5 9.2-100 Vector were linearized by Pad. The recombinant adenovirus was transfecled into HER293AD cells for packaging and amplification. Result:The recombinant adenovirus vector containing OPN gene was constructed successfully in vitro and OPN gene expression was increased significantly in HEK293AI) cell after infection by the recombinant virus. Conclusion: The recombinant adenovirus vector containing OPN gene was constructed successfully in vitro. It may be a useful tool for the research on the OPN gene.【期刊名称】《口腔颌面外科杂志》【年(卷),期】2012(022)004【总页数】5页(P233-237)【关键词】骨桥蛋白;腺病毒载体;质粒重组;基因克隆【作者】刘安娜;王佐林【作者单位】同济大学口腔医院口腔颌面外科,上海200072;同济大学口腔医院口腔颌面外科,上海200072【正文语种】中文【中图分类】R782.2;Q78骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种具有多种生物活性的分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，其相对分子质量为4.15×104。

腺病毒介导的基因治疗在骨创伤及骨病中的应用

腺病毒介导的基因治疗在骨创伤及骨病中的应用

腺病毒介导的基因治疗在骨创伤及骨病中的应用刘继中;纪宗玲;胡蕴玉【期刊名称】《中国修复重建外科杂志》【年(卷),期】2003(17)3【摘要】目的介绍腺病毒介导的基因治疗的特点及其在骨创伤和骨病中的应用。

方法广泛查阅有关重组腺病毒载体的制备原理、特点及应用研究进展等方面的文献 ,并总结腺病毒介导的基因治疗在促进骨愈合、治疗骨质疏松及类风湿性关节炎等骨病研究中的应用情况。

结果腺病毒载体具有高转染率、目的基因的高表达率及在宿主细胞内的表达有一定的时限等特点 ,能有效转染软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨髓基质细胞、关节滑膜细胞、椎间盘髓核细胞及成纤维细胞等 ,适用于骨折愈合、脊柱融合、骨质疏松及类风湿性关节炎等骨病的基因治疗。

结论腺病毒介导的基因治疗可望为骨创伤、骨病的治疗提供新的途径。

【总页数】4页(P215-218)【关键词】腺病毒介导;基因治疗;骨创伤;骨病;重组腺病毒载体;基因治疗;应用【作者】刘继中;纪宗玲;胡蕴玉【作者单位】第四军医大学西京医院全军骨科研究所;第四军医大学生物化学与分子生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】R68【相关文献】1.腺病毒介导的人骨形成蛋白2基因转染促进下颌牵张成骨的实验研究 [J], 陈安威;魏奉才;王克涛;孙善珍;刘少华2.腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因治疗骨缺损的研究 [J], 焦鲲;罗树林;尹峰3.骨形成蛋白2重组腺病毒的构建对骨缺损基因治疗的价值 [J], 王德利;阮狄克;李海峰;马巍;刘碧波;杨敏杰4.腺病毒介导的人骨形成蛋白2基因治疗的免疫学研究 [J], 徐小良;戴尅戎;汤亭亭;严孟宁;朱振安;郁朝锋;徐旻;楼觉人5.腺病毒介导的骨形成蛋白-2基因修饰促进羊骨髓基质细胞成骨分化的实验研究[J], 张秀丽;蒋欣泉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Piezo机械敏感性离子通道在骨关节组织中的研究进展

Piezo机械敏感性离子通道在骨关节组织中的研究进展

• 50 •国际生物医学工程杂志2021.年2月第44卷第1期lnt J Biom ed Eng. Februan 2021, Vol.44. No.l•综述•Piezo机械敏感性离子通道在骨关节组织中的研究进展张超王平刘爱峰张君涛李远栋天津中医药大学第一附属医院骨伤科3003 80通信作者：王平，Email:yfywangping@【摘要】机械敏感性离子通道是细胞表面机械力学刺激转化为细胞内电信号或化学信号的机械感受器。

近年来,在真核生物中Piezo蛋白作为机械敏感性阳离子通道逐渐成为研究热点,Piezol和Piez〇2蛋白在哺乳动物不同器官和组织中表达，而骨关节等组织与力学传导直接相关,机械力的传导及引起的细胞内效应对骨科疾病的治疗和预防起着非常重要的作用:就Piezo蛋白机械敏感性离子通道在骨组织、软骨组织、骨髓组织、椎间盘组织以及在骨科疾病中的研究进展进行综述：【关键词】P i e z o;机械敏感性离子通道；骨关节组织；研究进展基金项目：天津市卫生健康委员会中医、中西医结合科研专项课题(2019066,2017118);王平劳模创新工作室-天津市教委资助项目（津教工[2016]3号）1)01:10.3760/rma.j .c n 121382-20200914-00109Research progress of Piezo mechanosensitive ion channels in bone and joint tissues Zhang Chao, Wang Ping,Liu A if e ng, Zhang Juntao, Li Y u andongOrthopedics Department, the First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin300380, ChinaCorresponding author: Wang Ping, Email: yfywangping@sincucorn【Abstract】Mechanosensitive ion channels are mechanoreceptors that convert mechanical stimulation on thecell surface into intracellular electrical signal or chemical signal. In recent years. Piezo protein as a mechanicallyactivated cation channel in eukaryotes has gradually become a research hotspot. Piezo 1and Piezo2 proteins areexpressed in different organs and tissues of mammals, and tissues such as bones and joints are directly related tomechanical conduction. The intracellular effects caused by the conduction of mechanical force play a very importantrole in the treatment and prevention of orthopedic diseases. In this paper, the researches on Piezo proteinmechanically activated cation channels in bone tissue, cartilage tissue, hone maiTow tissue, intervertebral disc tissueand orthopedic diseases were reviewed.【Keywords】Piezo; Mechanosensitive ion channels; Bone and joint tissue; Research progressFund programs：Tianjin Health Commission of Traditional Chinese Medicine, Integrated Traditional Chineseand Western Medicine Special Research Project (2019066, 2017118); Fund for the Innovation Studio of ModelWorker (Skilled Talent) from the Tianjin Municipal Education Commission (2016-3)DOI: 10.3760/ 121382-20200914-00109〇引言机械敏感性离子通道（mechanosensitiveion ion diarniels.MSCs)是活细胞表面的机械刺激转化为细 胞内电信号或化学信号时主要的机械感受器，并与 细胞骨架一起构成机械感受器体系n_3):力学传导是 细胞接受和转化力学刺激为生物信号的过程，对器 官发育和大量生理活动有重要意义141。

高致病性血清4型禽腺病毒hexon基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

高致病性血清4型禽腺病毒hexon基因在昆虫细胞中的表达及鉴定梅梅;陆吉虎;张雪花;唐应华;侯继波【摘要】为获得杆状病毒表达的重组高致病性血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)六邻体蛋白(Hexon),本研究通过PCR从高致病性血清4型禽腺病毒基因组中扩增到hexon基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-1,获得重组转移质粒pFastBac-hexon,将其转化DH10Bac大肠杆菌并筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-hexon,将重组杆状病毒穿梭质粒转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBV-hexon.间接免疫荧光试验和免疫印迹试验结果显示,Sf9细胞中的Hexon蛋白能够与血清4型禽腺病毒阳性血清发生特异性反应,蛋白质分子量约110000,表明Hexon蛋白在Sf9细胞中获得良好的表达.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2018(034)004【总页数】4页(P862-865)【关键词】高致病性血清4型禽腺病毒;六邻体蛋白;hexon基因【作者】梅梅;陆吉虎;张雪花;唐应华;侯继波【作者单位】江苏省农业科学院动物免疫工程研究所,江苏南京 210014;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京 210014;江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州 225009;江苏省农业科学院动物免疫工程研究所,江苏南京 210014;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京 210014;江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州 225009;江苏省农业科学院动物免疫工程研究所,江苏南京 210014;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京 210014;江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州 225009;江苏省农业科学院动物免疫工程研究所,江苏南京 210014;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京 210014;江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州 225009;江苏省农业科学院动物免疫工程研究所,江苏南京 210014;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京 210014;江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州 225009【正文语种】中文【中图分类】S855.3禽腺病毒(FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，主要分为5个种(A～E)，12个血清型[1]。

BMP

BMP作者：徐志泉，易着文，何小解【摘要】 BMP-4通过Smad等信号转导系统将细胞表面信号转入细胞核。

BMP-4调控早期胚胎发育；BMP-4诱导成骨、促进骨胶原生成、骨痂的形成和再塑，从而使骨完美修复；BMP-4是维持神经健康和再生的神经营养因子，能促进神经干细胞增殖分化，使新生的神经元迁移到颗粒细胞层分化为成熟的颗粒神经元，还刺激胶质细胞合成神经营养因子；BMP-4诱导内耳感觉上皮祖细胞分化为毛细胞，还参与了内耳神经纤维的形成和发育；BMP-4通过Msx2促进了牙胚的发育和调控釉结细胞的凋亡；BMP-4调控肺动脉平滑肌细胞增殖、分化以及细胞外基质的合成。

BMP-4调控多种组织的增殖分化，提示BMP-4有望成为干细胞治疗的调控因子，在器官再生、修复、定向重构等再生医学中起重要作用。

【关键词】骨形态发生蛋白4；增殖；分化；再生增殖分化在器官组织的功能结构的正常维持中具有重要作用。

骨形态发生蛋白4在多种脏器中表达，BMP-4主要作用于未分化间叶组织细胞，对多种细胞的增殖分化具有调控作用。

对BMP-4的研究利于揭示器官组织生成发育机制和再生修复机制。

1 BMPs种类BMPs家族属于TGF-β超家族，该家族已经发现40多个成员，包括BMPs、生长和分化因子、活化素、抑制素、苗勒管抑制物质和TGF-β。

TGF-β超家族成员是以前体大分子的形式合成，经过蛋白水解酶切割从前肽区释放出成熟蛋白。

已经发现的BMPs有15种，根据氨基酸序列分为3个亚群：BMP-2和BMP-4、BMP-5、BMP-8、BMP-3和GDF-10。

除BMP-1外，每个成员都有骨诱导的功能［1］。

BMP-2诱导鼠胚胎间充质干细胞 C3H10T1/2成脂肪分化［2］。

TGF-β1/Smads信号通路是急慢性肾脏病肾脏纤维化重要的转导通路。

BMP-7不仅影响TGF-β1/Smads通路的信号转导，还与TGF-β1存在互逆作用，可多方面抵消TGF-β1的促肾纤维化作用［3，4］；BMP-7在急慢性心脏损害心肌纤维化过程中也发挥了负性调节的作用［5］；BMP-7在缺血和缺氧性损伤尾壳核细胞内的表达并参与损伤修复［6］。

哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。

与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。

从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。

本文主要从表达系统及其两个组成部分一一表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。

研究现状①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。

②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。

如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子皿、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素出，集落刺激因子等。

有些产品已投入临床应用或试用。

③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30^g/l08细胞/24小时。

有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中（对于重组蛋白来讲，常是异源的），重组蛋白的分泌效率较低。

1表达载体1. 1表达栽体的类型哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。

利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。

根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。

病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。

常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒（sFv）载体等。

腺病毒载体构建ppt课件


安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞
基因组外游离状态下表整达理版，课整件合突变致癌可能性小。
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几种病毒载体的区别
整理版课件
10
整理版课件
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腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
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重组系统由2种质粒 构成：一、包含全
部（或右侧大部分） 腺病毒基因组DNA 的大质粒，即骨架 质粒
6
二、小的穿梭质粒，其带有
目的基因的表达盒以及表达
盒两侧的与大质粒上的目的
基因拟插入部位同源序列
（左右臂）
整理版课件
7
整理版课件
包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
E2蛋白涉及AdDNA复制
E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统
E4蛋白调节有效的晚期基因转录
整理版课件
4
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
•腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒 症状、呼吸系统不适等。
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【Abstract】 O bjective To con struct a rep lica tion 2defective recom b inan t ad inoviru s includ ing the ta rget gene
hum an bone m o rp hogenetic p ro tein 4 ( fragm en t hBM P 24 ). M ethods T he hBM P 24 gene fragm en t w a s cu t dow n from pCS2 ( + ) hBM P 24, cloned in to the euka ryo tic exp ressive vecto r p cDNA 3. 1 ( + ) , then subcloned in to p Shu ttle2 CM V and tran sfo rm ed in to the com p eten t E. co li BJ 5183 p by electropo ra tion. T he resu lting recom b inan t p la sm id pA dE hBM P 24 w a s tran sfo rm ed in to the p ackag ing of the cell lines H EK293 to p roduce the rep lica tion 2defective recom b inan t adenoviru ses con ta in ing the hBM P 24 gene. T hese rep lica tion 2defective recom b inan t ad inoviru ses w ere tran sfected in to H EK293 and H eL a cells. T hen, to ta l RNA and to ta l p ro tein w ere detected by R T 2PCR and the W estern 2b lo t a ssay. Results T he pA dE hBM P 24 w a s confirm ed by the restrictiona l endonuclea se d igestion. In H EK293 and H eL a cells, the sp ecific tran scrip tion of the hBM P 24 gene w a s confirm ed by R T 2PCR , and the exp ression of the hBM P 24 p ro tein w a s confirm ed by the W estern 2b lo t a ssay. Conclusion T he rep lica tion 2defective recom b inan t ad inoviru s exp ression vecto r con ta in ing the hBM P 24 gene can be con structed and exp ressed successfu lly, w h ich ha s la id a founda tion fo r the fu rther resea rch on the genetherap y of hBM P 24.
【Key words】 Bone m o rp hogenetic p ro tein 4 R ep lica tion 2defective recom b inan t ad inoviru s Genetherap y Founda tion item : N a tu ra l Science Founda tion of A nhu i P rovince ( 20042021)
2 安徽医科大学免疫学教研室
骨细胞分化的作用, 并且是已知的唯一具有异位成骨 能力的细胞因子。BM P 22、 24 和27 是其中仅有的能单 独促进体内异位成骨和体外新骨形成的因子[ 1 ]。 目前国内 BM P 是当前组织工程的研究热点之一。 外多采用高分子材料与基因重组技术生产BM P 复合 以促进骨缺损修复, BM P 早期呈爆发式释放, 随后浓 度很快下降至治疗水平以下, 其半衰期短, 难以持续发 挥作用, 且价格非常昂贵, 如何使BM P 持续高效地发 挥作用一直是骨组织工程的难点之一。 基因治疗是组 织工程近年来的研究方向, 将特定的基因转入目标细 胞, 使之能够合成由这段基因编码的蛋白质[ 2 ]。 通过将
p cDNA 3. 1 ( + ) , 再亚克隆至 p Shu ttle2 CM V , 电转化至含有 pA dEa sy21 骨架质粒的 E. co li BJ 5183 p 中进行同源重组, 重
组质粒转染 H EK293 细胞包装成含有 hBM P 24 基因的非复制型腺病毒。 病毒颗粒感染 H EK293 和 H eL a 细胞, 提取总
# 现在安徽医科大学第一附属医院急诊外科 通讯作者: 汪春兰, 教授, 硕士导师, 研究方向: 组织工程
中国修复重建外科杂志 2007 年 4 月第 21 卷第 4 期
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编码BM P 的基因转入靶细胞可以在骨缺损局部产生 并 持续释放 BM P , 诱导新骨的形成, 从而促进骨缺损 的修复, 更好地达到运用BM P 治疗的目的[ 3 ]。BM P 24 是骨诱导活性最强的 BM P 之一[ 4 ] , 构建一种表达人 BM P 24 ( hum an BM P 24, hBM P 24) 的腺病毒表达载体, 为进一步研究其在骨及软骨组织修复重建基因治疗中 的作用打下基础。
骨形成蛋白 (bone m o rp hogenet ic p ro tein, BM P ) 是属于转化生长因子 Β( t ran sfo rm ing g row th facto r Β ,
) 超家族的多功能细胞因子, 迄今已分离出 20 T GF 2Β
BM P 还具有诱导多能间充质干细胞向成骨细胞和软
RNA 和总蛋白, 进行 R T 2PCR 和W estern 2 b lo t 检测。 结果 获得了含有目的基因 hBM P 24 的非复制型腺病毒表达载
体 pA dE hBM P 24, 酶切鉴定提示构建正确, R T 2PCR 检测到 hBM P 24 基因的转录,W estern 2 b lo t 检测到 hBM P 24 蛋白表 达。 结论 将目的基因 hBM P 24 克隆至非复制型腺病毒表达载体中, 为进一步研究其在基因治疗骨缺损中的应用奠定 基础。 【关键词】 骨形成蛋白 4 非复制型腺病毒 基因治疗 中图分类号: R 78 Q 813 文献标识码: A
CO NSTRUCT I O N AND
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I D ENT IF ICAT I ON OF
REPL ICAT I O N-D EFECT IVE
RECOM B INANT AD INO V IRUS
EXPRESS ING HUM AN BO NE MO RPHO GENET IC PRO TE IN 4 W A N G X ingy u , W A N G C hun lan , ZH A O Y u , et a l.
1 材料与方法 1. 1 材料 pCS2 ( + ) hBM P 24 质粒由波兰L udw ik H irszfeld
用Pm e 酶切线性化, 无水乙醇回收。 回收产物用电穿 孔法转化含有腺病毒骨架质粒pA dEa sy 21 的E. co li BJ 5183 p 进行同源重组, 涂 Kana + LB 平板、 挑克隆、 摇 菌、 小量提取质粒。用 EcoR 、 B am H 、 Pac 分别对 重组质粒进行酶切鉴定。 将酶切证实正确连接的重组 质粒命名为pA dE hBM P 24, 用CaC l2 法转化至 E. co li DH 10B , 扩增后用 PEG 8000 大量制备和纯化质粒 pA dE hBM P 24, 电泳定量约 1 Λg Λl。 1. 2. 4 复制缺陷型腺病毒 Pac 酶切线性化重组的 腺病毒质粒 pA dE hBM P 24, 将酶切产物用阳离子脂 质 体 L ipofectam ine22000 转 染 至 培 养 密 度 约 90% 收集出现典 H EK293 细胞中, 逐日观察细胞病变效应。 型病变 ( 约 1 周左右) 的细胞及其培养上清, 反复冻融 后离心获取病毒液, 取原液及逐级稀释的病毒液接种 至新的 H EK293 细胞, 进行病毒扩增。
D ep a rtm en t of P lastic S u rg ery , F irst A f f ilia ted H osp ita l of A nhu i M ed ica l U n iv ersity , H ef ei A nhu i , 230022, P. R . C h i2 na. E 2 m a il: w ang 2 w xy @ 126. com C orresp ond ing au thor: W A N G C hun lan
【摘 要】 目的 构建含有人骨形成蛋白4 ( hum an bone m o rp hogenetic p ro tein 4, hBM P 24) 的非复制型腺病毒表 达载体 pA dE hBM P 24 并检测其表达。 方法 酶切质粒 pCS2 ( + ) hBM P 24 获得目的基因片段, 克隆至真核表达载体
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. 21, N o. 4 Ch inese Jou rnal of R eparative and R econ structive Su rgery, A p ril 2007, V o l
表达人骨形成蛋白 4 的非复制型腺病毒的构建与鉴定
王兴宇1# 汪春兰1 赵宇1 王帮河1 姚远1 朱华锋1 何金生2
余种。 分化、 凋 BM P 在胚胎发育期起着调节细胞生长、 亡、 趋化、 血管和基质生成等作用, 如: BM P 22 与心脏 发育有关, BM P 24 参与中胚层的形成, BM P 26 调节上 皮的增殖, BM P 27 在肾及输尿管的形成中发挥作用。