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第六章微生物的生长及其控制微生物不论其在自然条件下还是在人为条件下发生作用，都是通过“以数取胜”或“以量取胜”。
生长和繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。
微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物的个体大小、群体数量或两者的增长。
个体细胞生长：细胞内组分的增加，导致细胞总量（体积、质量、大小）扩个体繁殖：是微生物个体生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通由于微生物个体微小，以个体为对象研究其生长和繁殖十分不便，常以群体数量的变化来研究微生物的生长。
在微生物学中，凡说“生长”一般均指群体生长，这与研究大型生物有所不同。
群体生长：指在一定时间和条件下，微生物细胞总量的增加。
既有量变也有质变。
三者之间的关系：个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖第一节测定生长繁殖的方法测定生长的方法是以原生质含量的增加为基础，测定繁殖是建立在计算个体数目上。
一、测生长量直接方法：测菌体细胞（数）量、菌体体积、菌体质量等；间接方法：根据细胞内某种物质的含量或某种代谢活动强度间接测定。
（一）直接法1、测体积这是一种粗放的方法。
将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或离心沉降，观察其体积。
污泥沉降比（SV）：为含有污泥的混合液在量筒中静置30 min后所形成的沉淀污泥的容积占原混合液容积的百分数，以%表示。
又叫30 min沉淀率。
该参数是评定活性污泥质量的重要指标之一。
正常范围为15-30%。
2、称重此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。
它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。
包括称干重（DCW）和湿重。
将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重。
如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
第六章微生物的生长一、名词解释01.细菌生长曲线（growth curve）：当细菌在适宜的环境条件下培养时，如果以培养的时间为横座标，以细菌数量变化为纵坐标，根据细菌数量变化与相应时间变化之间的关系，作出一条反应细菌在培养期间菌数变化规律的曲线，这种曲线称为生长曲线。
02.菌落形成单位（colony forming unit, cfu）：通过浇注或涂布等方法使菌样的微生物单细胞分散在平板上（内），待培养后，每一个活细胞就形成一个单菌落，即为菌落形成单位。
03.比生长速率（specific growth rate）：单位数量的细菌或物质在单位时间（h）内的增加量。
04.同步培养（synchronous culture）：是一种培养方法，它能使群体中的所有细胞变成处于同时进行生长和分裂的群体细胞。
05.连续培养（continuous culture）：是在微生物的整个培养时间内，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续下去的一种培养方式。
06.连续发酵（continuous fermentation）：连续培养如果应用于生产实践上，就称为连续发酵。
07.分批培养：将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获，此称为分批培养。
08.二元培养：是纯培养的一种特殊形式。
根据寄生微生物的生活特点，必须将寄生微生物和寄主微生物培养在一起，同时排除其它杂菌。
例如培养苏云金杆菌及其噬菌体，需先在平板培养基上培养细菌，然后在菌苔上接种其噬菌体，经培养后，出现噬菌体感染的透明空斑，这种培养方法称为二元培养。
09.高密度培养（high cell-density culture, HCDC）：有时也称高密度发酵，一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过了常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。
10.致死时间（thermal death time, TDT）：是指在特定的条件和特定的温度下（如60℃），杀死某微生物水悬乳液群体所需要的最短时间。
第六章纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.纯培养的方法：见PPT第七章里的第七张稀释倒平板法首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物.平板划线分离法分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）选择培养基分离法倾注平板法平板涂布分离法简单易行，但易造成机械损伤单细胞（单孢子）分离法要在显微镜下进行倾注平板法比较常用的方法,但对热敏感菌及严格耗氧菌不太适合.典型的生长曲线：课本153典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等4个时期延滞期：延滞期又称停滞期、调整期或适应期。
指少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中后,在开始培养的一段时间内,因代谢系统适应新环境的需要,细胞数目没有增加的一段时期。
该期的特点为:①生长速率常数为零;②细胞形态变大或增长,许多杆菌可长成丝状③细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高,原生质呈嗜碱性;④合成代谢十分活跃,核糖体、酶类和ATP的合成加速,易产生各种诱导酶;⑤对外界不良条件如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏感。
影响延滞期长短的因素很多,除菌种外,主要有3种:1.接种龄指接种物或种子的生长年龄, 即它生长到生长曲线上哪一阶段时用来作种子的。
这是指某一群体的生理年龄。
实验证明,如果以对数期接种龄的种子接种,则子代培养物的延滞期就短;反之,如以延滞期或衰亡期的种子接种则子代培养物的延滞期就长; 如果以稳定期的种子接种, 则延滞期居中。
2.接种量接种量的大小明显影响延滞期的长短。
一般说来,接种量大,则延滞期短,反之则长因此,在发酵工业上,为缩短延滞期以缩短生产周期,通常都采用较大的接种量(种子∶发酵培养基= 1∶10 ,V/ V)。
3.培养基成分接种到营养丰富的天然培养基中的微生物,要比接种到营养单调的组合培养基中的延滞期短。
所以,一般要求发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近,且应适当丰富些。
出现延滞期的原因,是由于接种到新鲜培养液的种子细胞中,一时还缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶,或是缺乏充足的中间代谢物。
为产生诱导酶或合成有关的中间代谢物,就需要有一段用于适应的时间,此即延滞期。
指数期：指数期又称对数期( logarithmic phase ) ,指在生长曲线中,紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。
指数期的特点是:①生长速率常数R最大,因而细胞每分裂一次所需的时间--代时，或原生质增加一倍所需的倍增时间最短; ②细胞进行平衡生长, 故菌体各部分的成分十分均匀;③酶系活跃,代谢旺盛。
影响指数期微生物代时长短的因素很多,主要是:①菌种:不同菌种其代时差别极大,②营养成分:同一种微生物,在营养丰富的培养基上生长时,其代时较短,反之则长③营养物浓度:营养物的浓度既可影响微生物的生长速率,又可影响它的生长总量，只有在营养物浓度很低( 0.1～2.0 mg/ mL) 时, 才会影响微生物的生长速率。
随着营养物浓度的逐步提高( 2.0～8.0 mg/ mL ) ,生长速率不受影响,而仅影响到最终的菌体产量。
如进一步提高营养物浓度,则已不再影响生长速率和菌体产量了。
凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物,就称生长限制因子④培养温度:温度对微生物的生长速率有明显的影响指数期的微生物因其具有整个群体的生理特性较一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点,故是用作代谢、生理等研究的良好材料,是增殖噬菌体的最适宿主,也是发酵工业中用作种子的最佳材料稳定期稳定期又称恒定期或最高生长期。
其特点是生长速率常数R等于零,即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等,或正生长与负生长相等的动态平衡之中。
这时的菌体产量达到了最高点,而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系,进入稳定期时,细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物;芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢;有的微生物在这时开始以初生代谢物作前体,通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物。
所以,次生代谢物又称稳定期产物。
由此还可对生长期进行另一种分类,即以指数期为主的菌体生长期和以稳定期为主的代谢产物合成期。
稳定期到来的原因是:①营养物尤其是生长限制因子的耗尽;②营养物的比例失调稳定期的生长规律对生产实践有着重要的指导意义,例如,对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸等)为目的的某些发酵生产来说,稳定期是产物的最佳收获期;对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定(bioassay)来说,稳定期是最佳测定时期;此外,通过对稳定期到来原因的研究,还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建衰亡期( decline phase 或death phase)在衰亡期中,微生物的个体死亡速度超过新生速度,整个群体呈现负生长状态。
这时,细胞形态发生多形化,例如会发生膨大或不规则的退化形态;有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶( autolysis) ;有的微生物在这期会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物;而在芽孢杆菌中,往往在此期释放芽孢;等等。
产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利,从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢,继而导致大量菌体死亡。
恒浊与恒化培养的区别装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度无限制生不恒定最高速率大量菌体或与菌体相平生产为主( 内控制)长因子行的代谢产物恒化器培养基流速有限制生恒定低于最高速不同生长速率的菌体实验室为主( 外控制)长因子率厌氧菌因不能合成SOD,所以根本无法使O2·歧化成H2O2,因此,在有氧存在时,细胞内形成的O2·就使自身受到毒害PH调节：过酸时:加NaOH、Na2CO3等碱液中和“治标”过碱时:加H2SO4、HCl等酸液中和过酸时加适当氮源: 加尿素、NaNO3、NH4 OH或蛋白质等提高通气量“治本”过碱时加适当碳源: 加糖、乳酸、醋酸、柠檬酸或油脂等降低通气量灭菌( sterilization)：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施,称为灭菌,灭菌实质上还可分杀菌( bacteriocidation)和溶菌( bacteriolysis)两种,前者指菌体虽死,但形体尚存;后者指菌体被杀死后,其细胞因发生自溶、裂解等而消失的现象消毒：是采用较温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌,而对被消毒的对象基本无害的措施1.干热灭菌法(dry heat sterilization)把金属器械或洗净的玻璃器皿放入电热烘箱内,在150～170℃下维持1～2 h后,可达到彻底灭菌的目的。
干热可使细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥,并可使各种细胞成分发生氧化变质。
灼烧是一种最彻底的干热灭菌法,可是因其破坏力很强,故应用范围仅限于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。
2.湿热灭菌法(moist heat sterilization)湿热灭菌法是指用100℃以上的加压蒸气进行灭菌。
在同样温度和相同作用时间下,湿热灭菌法比干热灭菌法更有效,原因是湿热蒸气不但透射力强,而且还能破坏维持蛋白质空间结构和稳定性的氢键,从而加速这一重要生命大分子物质的变性。
在湿热温度下,多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10 min后即被杀死,酵母菌细胞和真菌的孢子稍耐热些,要在80℃下才被杀死,细菌的芽孢最耐热,一般要在120℃下处理15 min 才被杀死。
①巴氏消毒法:因最早由法国微生物学家巴斯德用于果酒消毒,故名。
这是一种专用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。
此法可杀灭物料中的无芽孢病原菌,又不影响其原有风味。
巴氏消毒法是一种低温湿热消毒法,处理温度变化很大,一般在60～85℃处理30 min至15 s。
具体方法可分两类:第一类是经典的低温维持法, 例如用于牛奶消毒只要在63℃下维持30 min 即可; 第二类是较现代的高温瞬时法,用此法作牛奶消毒时只要在72℃下保持15 s。
②煮沸消毒法:采用在100℃下煮沸数分钟的方法,一般用于饮用水的消毒。
3.间歇灭菌法:又称分段灭菌法或丁达尔灭菌法。
适用于不耐热培养基的灭菌。
方法是:将待灭菌的培养基放在80～100℃下蒸煮15～60 min ,以杀灭其中所有的微生物营养体,然后放至室温或37℃下保温过夜,诱使其中残存的芽孢发芽,第二天再以同法蒸煮和保温过夜,如此连续重复3天即可在较低的灭菌温度下同样达到彻底灭菌的良好效果。
4常规加压蒸气灭菌法:一般称作“高压蒸气灭菌法”,但因其压力范围甚低，故改用“加压”两字更合适。
这是一种利用高温进行湿热灭菌的方法,优点是操作简便、效果可靠,故被广泛使用。
其原理是:将待灭菌的物件放置在盛有适量水的专用加压灭菌锅内,盖上锅盖,并打开排气阀,通过加热煮沸,让蒸气驱尽锅内原有的空气,然后关闭锅盖上的阀门,再继续加热,使锅内蒸气压逐渐上升,随之温度也相应上升至100℃以上。
为达到良好的灭菌效果,一般温度应达到121℃,时间维持15～20 min。
有时为防止培养基内葡萄糖等成分的破坏,也可采用在较低温度下维持35 min的方法。
加压蒸气灭菌法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材或物料的灭菌热死时间,指在某一温度下,杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。
热死温度,又称热死点,指在一定时间内,杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度影响加压蒸气灭菌效果的因素1.灭菌物体含菌量2.灭菌锅内空气排除程度3.灭菌对象的pH4.灭菌对象的体积5.加热与散热速度灭菌锅空气没有排尽有啥影响：因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。
抗生素是一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物,它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物(包括病原菌,病毒,癌细胞等)的生命活动,因而可用作优良的化学治疗剂。
第七章什么叫杂交育种及其理论基础与区别诱变育种的整个过程诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群,在促进其突变率显著提高的基础上,采用简便、快速和高效的筛选方法,从中挑选出少数符合目的的突变株,以供科学实验或生产实践使用。
