HPLC方法开发
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分离度是色谱分离中主要考虑的因素 除分离度之外,在开发色谱方法时,以下几个因素也都要考 虑: 灵敏度 成本 载样量 容易使用 分析速度 色谱柱寿命 溶剂损耗 效率
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10
方法开发的一般步骤
文献检索, 同事, 思考?
逐步的重复过程 下一步的实验设计基于上一次实验的结果
50/50、40/60，由强渐弱
– 流速： 流速：2ml/min
样品： 样品：
– ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) – ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) – ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)
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22
① ① ③ ④ ① ③ ④ ③
1.如用 1.如用PIC 如用PICPIC-B7， B7， 在②③分开的情 ②③分开的情 况下， 况下，保留时间 太长
2.如用 2.如用PIC 如用PICPIC-B5， B5， 峰①②④分不 ①②④分不 开
3.如用 3.如用PIC 如用PICPIC-B7 加B5， B5，各组份 分开， 分开，且保留 时间合适
H3C N
N
NH2 CH2N
}
Cl-
3. Riboflavin 核黄素， VB2
4. Thiamine 硫胺素，VB1
30
用不同的离子对试剂
②④ ② ②
色谱柱∶ 色谱柱∶ µ BondaPak C18 3.9mm 3.9mm× mm×300mm 溶剂∶1. 溶剂∶1.MeOH/H2O,PIC ∶1.MeOH/H2O,PICMeOH/H2O,PIC-B7 2.MeOH/H2O,PIC 2.MeOH/H2O,PICMeOH/H2O,PIC-B5 3.MeOH/H2O,PIC 3.MeOH/H2O,PICMeOH/H2O,PIC-B7/B5
配体密度的变化
– 影响样品的载荷率
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选择性工具
溶剂
pH
选择性
柱化学
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试剂工具
甲醇
– 弱洗脱剂 – H-键溶剂
乙腈
– 非质子溶剂 – 强洗脱剂 – 低粘度
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k′是保留因子,表达了被分离组分与柱填料 的作用强弱 α 是分离因子,描述两个组分分离的好坏程度, 是化学因素 N 是理论塔板数,描述色谱峰的谱带展宽程度
5
保留因子 k′
与峰高的关系 与R的关系
改变k'值的方法∶
– 调节流动相的极性、 调节流动相的极性、pH、离子强度等 – 梯度淋洗
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实例1:改变保留因子 k'
实例1谱图
① ① 50/50 ② ② ③ ③ 60/40 ③ ② 40/60 ①
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23
实例2:改变选择性(α)
通过改变流动相改变选择性
– 同样强度的不同溶剂
② ③
①THF / H 2 O， 28 : 72 ②MeOH / H 2 O， 58 : 42 ③CH 3 CN / H 2 O， 38 : 62
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20
反相保留图: 反相保留图: 流动相 pH 值的影响
40
Note: 中性化合物的保留不受 pH 值的影响
35 30 Retention Factor (k) 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 pH 8 10 12
Acid
Neutral
32
离子对色谱的优缺点
优点:
– 可用反相色谱分析离子 – 离子和中性化合物可在同一次色谱分析中完成 – 通过选择不同的PIC试剂可使选择性得到惊人的改善,
特别是对中性和离子型溶质 缺点:
– PIC 试剂的平衡较慢 – 推荐专用色谱柱作离子对分析 – 当心 PIC 试剂在甲醇,乙腈等溶剂中沉淀 – 当心用过的离子对试剂的化学污染
选择性工具
溶剂 选择性
pH
色谱柱化学
-键合相 -基础硅胶颗粒
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不同配体: 不同配体:不同的选择性
疏水性的变化
– 较长的烷基链会提供较强的保留
硅羟基活性的变化
– 影响峰的不对称和影响第二种相互作用
水解稳定性的变化
– 硅胶颗粒表面上键合相的数目越多,柱寿命越长
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25
离子抑制色谱实例
在乙腈/水及pH=7时， 多数保留时间很短， 很短，无 法完全分离。
CHO COONa CHO COOH
OCH3 OH 1 2 3 OCH3 4
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26
常用缓冲液及其pH值
名 称 pKa 2.12 (pKa1) 3.75 4.19 (pKa1) 4.75 5.57 (pKa2) 7.21 (pKa2) 9.24 12.32 (pKa3)
V1 N =σ W
Wσ –Wtan –Wh –W3σ –W4σ –W5σ
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2
方法 16 切线法 5.54 半峰高 9 3σ 16 4σ 25 5σ
8
α，k'，N:如何控制分离度?
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开发方法的其它考虑因素
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28
离子对色谱机理
C4
流动相加0.01M的
O
N C4
+
C4 C4
OH
-
PIC-A试剂
O
加
(C~C)n SO3 Na
+
C4
(C~C)n SO3
-
N
+
C4 C4
C4
Si O
Si C 18
O
O
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离子对色谱分析水溶性维生素
①
改变色谱柱的影响会更大
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24
离子抑制色谱
在稀溶液中: HAc H+ + Ac-
离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离 – 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 – 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的安全范围内 – 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）之间
系统筛查 评估 pH, 有机溶剂和固定相 选择以上三项最好的结合 微调/优化 (温度, 梯度坡度)
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11
参照文献方法时的注意事项
采用与文献方法相同的色谱柱(品牌,固定相,内径,长度 ), 否则不能重现文献结果 注意不同HPLC系统体积的差异,若系统体积不同,则不能重 现文献的梯度方法 注意尽量避免流动相对色谱柱的损害(pH,缓冲盐的种类和 浓度 ) 注意文献方法发表的年代背景,不要机械照搬,而应立足创新, 尽可能采用HPLC新技术
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12
方法开发有价值的信息
样品溶解度 被分析物数目
– 准备分离多少感兴趣的峰?
化学结构 官能团; 被分析物有何不同
– 可电离物质? pH将如何影响色谱?
检测特性
– 需要或可能的检测器种类?
浓度范围和定量需求 样品基质影响
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17
梯度洗脱时溶剂的选择
A（弱洗脱溶剂） 弱洗脱溶剂）溶剂的洗脱能力应该尽量的小， 溶剂的洗脱能力应该尽量的小，这样才能 够使最快洗脱的物质有一个很合理的保留（ 够使最快洗脱的物质有一个很合理的保留（K>1） B（强洗脱溶剂） 强洗脱溶剂）溶剂的洗脱能力应该非常的强， 溶剂的洗脱能力应该非常的强，这样才能 够使最晚出峰的物质有一个合理的保留（ 够使最晚出峰的物质有一个合理的保留（K<20） A和B应该能够非常好的混合 A和B应该尽量的没有粘滞性
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离子对色谱 - 水溶性维生素
保留时间与PIC试剂B之间的关系
36ml 保留体积 ml
) 1 B V ( 胺 硫 核黄素(VB2)
) 6 B V ( 吡哆素 烟酰胺
4ml B5
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50%(B5/B7)
B7
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2
评价液相色谱方法的标准
问题∶ 问题∶什么样的分离结果是好的? 什么样的分离结果是好的?分离度? 分离度?
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3
什么是液相色谱的分离度？ 什么是液相色谱的分离度？
分离度的定义： 分离度的定义：
v2 − v1 R= 1 (w 2 + w1 )
N CONH2
H3C HO N CH2OH CH2OH
CH2OH
1. Niacinamide 烟酰胺 2. Pyridoxine 吡哆素， VB6
S CH2CH2OH CH3 +
HO HO HO H3C H3C
CH CH CH CH2 N N O N N O
{
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酸保留增加 碱保留增加
Base
无机硅胶 杂化填料
硅胶 pH 范围 杂化颗粒 pH 范围
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方法开发的一般步骤
文献检索, 同事, 思考?
逐步的重复过程 下一步的实验设计基于上一次实验的结果
50/50、40/60，由强渐弱
– 流速： 流速：2ml/min
样品： 样品：
– ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) – ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) – ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)
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① ① ③ ④ ① ③ ④ ③
1.如用 1.如用PIC 如用PICPIC-B7， B7， 在②③分开的情 ②③分开的情 况下， 况下，保留时间 太长
2.如用 2.如用PIC 如用PICPIC-B5， B5， 峰①②④分不 ①②④分不 开
3.如用 3.如用PIC 如用PICPIC-B7 加B5， B5，各组份 分开， 分开，且保留 时间合适
H3C N
N
NH2 CH2N
}
Cl-
3. Riboflavin 核黄素， VB2
4. Thiamine 硫胺素，VB1
30
用不同的离子对试剂
②④ ② ②
色谱柱∶ 色谱柱∶ µ BondaPak C18 3.9mm 3.9mm× mm×300mm 溶剂∶1. 溶剂∶1.MeOH/H2O,PIC ∶1.MeOH/H2O,PICMeOH/H2O,PIC-B7 2.MeOH/H2O,PIC 2.MeOH/H2O,PICMeOH/H2O,PIC-B5 3.MeOH/H2O,PIC 3.MeOH/H2O,PICMeOH/H2O,PIC-B7/B5
配体密度的变化
– 影响样品的载荷率
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选择性工具
溶剂
pH
选择性
柱化学
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试剂工具
甲醇
– 弱洗脱剂 – H-键溶剂
乙腈
– 非质子溶剂 – 强洗脱剂 – 低粘度
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k′是保留因子,表达了被分离组分与柱填料 的作用强弱 α 是分离因子,描述两个组分分离的好坏程度, 是化学因素 N 是理论塔板数,描述色谱峰的谱带展宽程度
5
保留因子 k′
与峰高的关系 与R的关系
改变k'值的方法∶
– 调节流动相的极性、 调节流动相的极性、pH、离子强度等 – 梯度淋洗
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实例1:改变保留因子 k'
实例1谱图
① ① 50/50 ② ② ③ ③ 60/40 ③ ② 40/60 ①
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实例2:改变选择性(α)
通过改变流动相改变选择性
– 同样强度的不同溶剂
② ③
①THF / H 2 O， 28 : 72 ②MeOH / H 2 O， 58 : 42 ③CH 3 CN / H 2 O， 38 : 62
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反相保留图: 反相保留图: 流动相 pH 值的影响
40
Note: 中性化合物的保留不受 pH 值的影响
35 30 Retention Factor (k) 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 pH 8 10 12
Acid
Neutral
32
离子对色谱的优缺点
优点:
– 可用反相色谱分析离子 – 离子和中性化合物可在同一次色谱分析中完成 – 通过选择不同的PIC试剂可使选择性得到惊人的改善,
特别是对中性和离子型溶质 缺点:
– PIC 试剂的平衡较慢 – 推荐专用色谱柱作离子对分析 – 当心 PIC 试剂在甲醇,乙腈等溶剂中沉淀 – 当心用过的离子对试剂的化学污染
选择性工具
溶剂 选择性
pH
色谱柱化学
-键合相 -基础硅胶颗粒
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不同配体: 不同配体:不同的选择性
疏水性的变化
– 较长的烷基链会提供较强的保留
硅羟基活性的变化
– 影响峰的不对称和影响第二种相互作用
水解稳定性的变化
– 硅胶颗粒表面上键合相的数目越多,柱寿命越长
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离子抑制色谱实例
在乙腈/水及pH=7时， 多数保留时间很短， 很短，无 法完全分离。
CHO COONa CHO COOH
OCH3 OH 1 2 3 OCH3 4
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常用缓冲液及其pH值
名 称 pKa 2.12 (pKa1) 3.75 4.19 (pKa1) 4.75 5.57 (pKa2) 7.21 (pKa2) 9.24 12.32 (pKa3)
V1 N =σ W
Wσ –Wtan –Wh –W3σ –W4σ –W5σ
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方法 16 切线法 5.54 半峰高 9 3σ 16 4σ 25 5σ
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α，k'，N:如何控制分离度?
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9
开发方法的其它考虑因素
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离子对色谱机理
C4
流动相加0.01M的
O
N C4
+
C4 C4
OH
-
PIC-A试剂
O
加
(C~C)n SO3 Na
+
C4
(C~C)n SO3
-
N
+
C4 C4
C4
Si O
Si C 18
O
O
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离子对色谱分析水溶性维生素
①
改变色谱柱的影响会更大
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离子抑制色谱
在稀溶液中: HAc H+ + Ac-
离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离 – 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 – 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的安全范围内 – 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）之间
系统筛查 评估 pH, 有机溶剂和固定相 选择以上三项最好的结合 微调/优化 (温度, 梯度坡度)
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11
参照文献方法时的注意事项
采用与文献方法相同的色谱柱(品牌,固定相,内径,长度 ), 否则不能重现文献结果 注意不同HPLC系统体积的差异,若系统体积不同,则不能重 现文献的梯度方法 注意尽量避免流动相对色谱柱的损害(pH,缓冲盐的种类和 浓度 ) 注意文献方法发表的年代背景,不要机械照搬,而应立足创新, 尽可能采用HPLC新技术
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方法开发有价值的信息
样品溶解度 被分析物数目
– 准备分离多少感兴趣的峰?
化学结构 官能团; 被分析物有何不同
– 可电离物质? pH将如何影响色谱?
检测特性
– 需要或可能的检测器种类?
浓度范围和定量需求 样品基质影响
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梯度洗脱时溶剂的选择
A（弱洗脱溶剂） 弱洗脱溶剂）溶剂的洗脱能力应该尽量的小， 溶剂的洗脱能力应该尽量的小，这样才能 够使最快洗脱的物质有一个很合理的保留（ 够使最快洗脱的物质有一个很合理的保留（K>1） B（强洗脱溶剂） 强洗脱溶剂）溶剂的洗脱能力应该非常的强， 溶剂的洗脱能力应该非常的强，这样才能 够使最晚出峰的物质有一个合理的保留（ 够使最晚出峰的物质有一个合理的保留（K<20） A和B应该能够非常好的混合 A和B应该尽量的没有粘滞性
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离子对色谱 - 水溶性维生素
保留时间与PIC试剂B之间的关系
36ml 保留体积 ml
) 1 B V ( 胺 硫 核黄素(VB2)
) 6 B V ( 吡哆素 烟酰胺
4ml B5
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50%(B5/B7)
B7
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评价液相色谱方法的标准
问题∶ 问题∶什么样的分离结果是好的? 什么样的分离结果是好的?分离度? 分离度?
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什么是液相色谱的分离度？ 什么是液相色谱的分离度？
分离度的定义： 分离度的定义：
v2 − v1 R= 1 (w 2 + w1 )
N CONH2
H3C HO N CH2OH CH2OH
CH2OH
1. Niacinamide 烟酰胺 2. Pyridoxine 吡哆素， VB6
S CH2CH2OH CH3 +
HO HO HO H3C H3C
CH CH CH CH2 N N O N N O
{
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酸保留增加 碱保留增加
Base
无机硅胶 杂化填料
硅胶 pH 范围 杂化颗粒 pH 范围
