抗癌药物对ⅡDNA拓扑异构酶作用的实验具体步骤及方法
DNA拓扑异构酶在DNA形成环状和超螺旋结构中起重要作用。另一方面在DNA超螺旋结构的松懈、DNA单、双链的断裂以至再连接的过程均有赖于该酶的参与，从而使DNA的复制或重组成为可能，关于抗癌药如烃化剂和非烃化剂，其中许多是以DNA拓扑异构酶为靶点使之形成可断裂的DNA蛋白复合物从而引起DNA损伤，这是近年来发展起来的一个新的研究领域。
一、材料准备
1. 药物制备
（1）将药物溶解于0. mol/l Hepes缓冲液或含10%~20%的二甲基亚砜中或其它助溶剂中。
（2）其它80%~90%为0.1 mol/l Hepes缓冲液，pH6.7，使药物的最终浓度为0.2~0.4
mmol/l。
2. 反应液
（1）反应液体积为24 ul
（2）其中包含500 mmol/l Hepes pH6.7，50 mmol/l KCl 100 mmol/l NaCl，0.1 mmol/l
EDTA，10 mmol/l MgCl2，0.1 mmol/l ATP，50 ug/ml BSA，0.26ug P4DNA。
二、实验步骤
1. 实验将微量试管分组为
（1）加药管、不加药对照管，已知药（VP-16）对照管和标准管（含不同浓度的酶，根据所用酶的活性定出第一管的酶稀释度，然后依次成倍递减至第四管，第5管不含酶的空白管）。
（2）除空白对照管外将其与全部管中均加入酶液（浓度同标准管第一管的浓度）。
（3）放恒温水浴30 min 即刻用终止液停止反应（终止液：2%sodium dodecyl、20%甘油。0.05%溴酚蓝）。
2. 将以上各管的样本加到1%琼脂糖凝胶上在电泳缓冲液（90 mmol/l tris-boric
acid
pH8.3和2.5 mmol/l EDTA）中进行电泳，50V过夜。
3. 电泳终了将凝胶膜用溴乙啶染色（30~40 min），此时用紫外灯照射则DNA可显示荧光带。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：
将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将
其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它
标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过
碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示
出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材
一、试剂
变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.5)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材
22cm×15cm瓷盘
操作方法
1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照
相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转
变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸
纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻
板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和
滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
２００２年１０月 第２４卷第５期 地质技术经济管理 Ｇｅｏｌｏ舀ｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｏｃｔ．，２００２ Ｖｏ１．２４ Ｎｏ．５
土地开发整理项目预算审查的步骤和方法＊
张献忠，龙花楼 （国土资源部土地整理中心，北京１０００４４） ［摘要］通过分析近年来编制和审核国家投资土地开发整理项目预算中出现的问题，本文较 为全面地总结并论述了审查土地开发整理项目预算的步骤及方法，以便把好土地开发整理项 目的投资关，公正合理地确定投资规模。 ［关键词］土地开发整理；项目预算；审查；步骤和方法 ［中图分类号］Ｆ３０１．３ ［文献标识码］Ｂ ［文章编号］１００３．３９２０（２００２）０５．００１９．０４ 土地开发整理是指在一定区域内，按照土地利用总体规划或城市规划确定的目标和用 途，通过采取行政、经济、法律和工程技术手段，对土地利用状况进行调整、改造、综合 整治，提高土地利用率和产出率，改善生产生活和生态环境的过程。 土地开发整理的资金，是国家财政从新增建设用地有偿使用费中安排的专项资金。土 地开发整理项目预算审查是控制投资额度，提高投资效益，用好专项资金的重要措施。作 为审查人员，在实际工作中，应掌握好审查的步骤和方法，做到准确、全面、合理的审 定，无论增加或减少土地开发整理项目的投资，都应让土地开发整理项目规划设计单位心 服口服。
一审查土地开发整理项目预算的步骤
１．收集相关资料，做好准确工作 收集与土地开发整理项目预算配套的规划图、单体工程设计图以及规划设计报告，熟 悉并核对相关的图纸和报告。根据预算编制说明，收集预算中用到的所有定额、配套的取 费标准及相关的文件、规定等等。 ２．了解预算中作特殊说明的信息
・［基金项目］国家自然科学青年基金项目（４０２０１００１）。 ［收稿１３期］２００２－０７．１９；［修订１３期］２００２－０９．１８ ［第一作者简介］张献忠（１９６９．），女，工程师，现工作于国土资源部土地整理中心，主要从事土地开发整理项 目预算编制及项目管理方面的工作。
转染细胞的稳定筛选
1、药物筛选前的准备
药筛前应确定药物筛选浓度，不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可。
2、药物筛选注意事项
（1）药筛的时间
加药时间一般为转染后48h。但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h
空白对照
加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完，但还需继续加药。
（2）换液
如果加药后，细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。另外，随着细胞的代谢，抗生素的活性会降低，因此，每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。
3、克隆筛选注意事项
若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞，因此最好选择带有荧光较强的细胞。若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑。不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。因此，挑克隆时，应尽量多挑几个克隆，20个左右。
4、稳定克隆筛选步骤
（1）有限稀释法步骤
a) 将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可,若细胞生长很快药筛时可以在10cm的dish中进行）用胰酶消化下来
b) 对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数）
c) 计算后，用枪头吸取约200个细胞（其中有部分为死细胞）到10ml培养液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种
d) 然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul，这样有的孔就可能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96孔板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2-3个96孔板）
