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人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
107第 30 卷第 1 期2012 年 2 月广东医学院学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE V ol. 30 No. 1Feb. 2012实验教学是高校教学的重要组成部分，在培养了使学生更好地了解和掌握消毒灭菌知识和技能，学生分析和解决问题能力、培养严密的思维方法和通过在PPT 上讲解后，再由带教老师用实物进行操踏实肯干的工作作风等方面具有不可替代的作用。
作演示。
这个过程加强了学生的无菌操作意识，树要使实验室成为推行素质教育、培养学生创新精神立学生的无菌概念。
和实验能力的主要阵地，必须突破传统的教学观念 1.2 通过实际操作，培养学生动手实践的兴趣，确和教学模式，探讨不同层次、具有特色的、多样化立严格的无菌操作观念的实验教学方法。
《医学遗传学》是高等医学院校在经过适当改装后的实验室里，带教老师向学的一门必修课，外周血淋巴细胞培养和染色体制备生讲解细胞培养基的配制方法及要求后，由学生自是这门课程的重要实验教学项目之一，是综合性实己操作。
配制培养基是实验的重要环节之一，要求验项目。
该实验包括灭菌技术、培养基配制、采血在无菌条件下操作。
以往因为实验室条件所限，必接种、细胞培养、收集细胞制备标本、Ｇ显带处理须用预先在无菌实验室里配制好的培养基给学生做[1-2]和镜下观察分析等内容，实验过程繁琐，耗时实验，如果使用市售的培养基则成本费用高，并且长。
根据目前学生人数多以及本实验的特点，我们学生都没有动手的机会。
由于配制培养基是一项细进行了以下教学方法的探索和改进：微且繁琐的实验过程，一旦失败则后面的实验无法进行，要求带教老师把每一个细小的环节都仔细向1 多种实验手段结合，使繁琐的实验简单化学生交代清楚，包括一些操作的动作要领和容易出现的问题。
有些学生会忘记按无菌操作要求用酒精1.1 运用现代教学手段，了解实验中使用器械、物灯高温消毒试管口和玻璃器皿，或者忘记消毒玻璃品的清洗消毒灭菌程序安培，教师要预先强调并密切观察学生的操作，及由于学生初次接触本实验使用的仪器设备和试时纠正其错误，避免培养基被污染。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
2021人体外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析范文 细胞培养论文（专业范文8篇）之第三篇 摘要：对男性、女性的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析发现，在“男1”、“女2”视野中均可找到分散较好、形态较清晰且数量为46条的淋巴母细胞染色体。
介绍了不同秋水仙素终浓度(0. 3μg/ml、0. 6μg/ml)对染色体中期分裂相的影响，认为这两种终浓度的秋水仙素均适合应用到人外周血淋巴细胞染色体的制备过程当中。
找出了分裂相数量较少的原因，如PHA浓度、秋水仙素的细胞毒性、滴片的高度或力度不合适。
要多考虑秋水仙素浓度、秋水仙素处理时间这两个指标，进而找出染色体制备的最优因素水平组合。
关键词：人体外周血淋巴细胞,细胞培养,染色体核型 人体外周血中的淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，本实验对其进行体外培养，用植物血凝素(PHA) 将其转化为可进行有丝分裂的淋巴母细胞，再经72 h恒温培养、秋水仙素处理、低渗、固定、制片等步骤，得到了处于有丝分裂中期的分裂相。
1材料和方法 1.1材料、试剂与仪器 人体外周血淋巴细胞:采集男性、女性静脉外周血样各一份。
试剂:RPMI-1640培养粉等。
仪器:恒温培养箱等。
1.2方法 第一，配制低渗液溶液，进行器皿灭菌等其他准备。
第二，采血，对样本细胞进行收集、培养、染色、镜检。
第三，分析染色体核型。
2结果 2.1男性、女性淋巴母细胞染色体显微拍摄结果 经光镜观察，发现“男1”、“男2”、“女1”、“女2”染色体均呈紫红色，细胞核蛋白与染料结合紧密，染色效果较好。
2.2男性、女性淋巴母细胞染色体核型分析及编号图 因“男1”、“女2”视野中均可找到分散较好、形态较清晰且数量为46条的淋巴母细胞染色体，故选用其进行染色体核型分析。
“男1”、“女2”均共有23对染色体，其中，22对为常染色体，另外1对性染色体男性为XY，女性为XX。
按长度顺序、着丝粒类型等指标，可将其分为A～G七组:A组长度最长，着丝粒在中部或接近中部。
人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术的研究近年来，人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术受到了研究者们的极大关注，为研究人类基因组的结构、组成、表达、功能以及毒性性质等提供了重要的理论支持。
一、人外周血淋巴细胞的高分辨染色体制备技术1、技术基础：染色体制备技术基于染色体延伸链分析技术，可以在特定细胞类型中获得更多有关人外周血淋巴细胞的信息。
2、实验方法：首先，经过放免定向损伤，用VP-16/Adr真核表达载体PCR形成染色体重组，生成环状染色体；然后，用PCR用LUC7+2分离染色体，形成环染色体；最后，用IMD技术将染色体细化为单个的LUC7+2染色单体，并用Cross-Linking（CL）技术衍生细胞凋亡程序，即可获得高分辨率的染色体。
二、人外周血淋巴细胞的高分辨染色体制备技术的应用1、研究基因表达和表达调节：通过对人外周血淋巴细胞的染色体制备，可以研究基因表达和表达调节机制、调控水平及其功能，有助于研究人体健康和病理状态的机制。
2、研究药物作用：人外周血淋巴细胞的染色体制备技术可以很好的帮助研究中药的作用机制及其药效，为临床治疗使用提供理论依据。
三、未来发展1、对不同类型细胞的染色体制备技术的研究：进一步研究不同细胞的染色体制备技术，提供更多的信息，以更好地研究基因结构和功能。
2、研究不同材料的染色体制备技术：进一步完善不同类型材料染色体（如核酸、细胞类型或体液类型）染色体制备技术，为研究更多的生物信息提供参考。
综上所述，人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术日益受到研究者们的重视，他们可以利用这项技术研究人体健康状态及病理状态机制、研究药物作用机制和提供理论依据来指导临床治疗，为健康科学发展提供重要理论支撑。
未来，研究将持续着眼不同类型细胞和不同材料染色体制备技术，更加完善技术，帮助研究者更好地了解人体基因组结构、表达、功能和毒性性质的信息。
RDW 均增大,属不均一性大细胞贫血,红细胞巨幼样变。
红细胞指标M CV 、M CH 、H CHC 的测定是进行形态学分类的依据,过去把贫血分为大细胞、正细胞正色素、小细胞低色素、单纯小细胞4个类型,此法忽视了红细胞体积的异质性对指标准确性的影响,不能全面反映红细胞的病理变化。
笔者认为,M CV 及R DW 测定结合了红细胞形态学分类,可得到较可靠的初步诊断意见,进而做特殊检查可明确诊断。
M CV 、RDW 对缺铁性贫血与巨幼红细胞性贫血有较好的诊断价值,可作为一种快速、简单、方便、准确的筛选方法。
参考文献[1]丛玉隆.今日临床检验学[M].北京:中国科学技术出版社,1997:9.(收稿日期:2010-12-16)v通讯作者,E -mail:zh anggu oyuan9826@sin 。
#经验交流#外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会马 强,刘青松,蔡 燕,邢 艳,张国元v(川北医学院附属医院检验科,四川南充637000)摘 要:目的 总结该室外周血淋巴细胞培养及染色体制备的成功经验,供同行参考与借鉴。
方法 采用外周血淋巴细胞培养基接种外周全血,按照常规方法制作染色体标本,进行镜检。
结果 该室培养的淋巴细胞数量稳定,染色体核型质量佳。
结论 该室制作的染色体标本质量能满足临床染色体核型分析需要。
关键词:染色体; 外周血; 淋巴细胞DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2011.14.061文献标识码:B 文章编号:1673-4130(2011)14-1641-02 染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施,对优生优育工作有着重大意义[1]。
然而,染色体制备过程缺乏有效的质量控制,经验在染色体标本制备过程中占有重要的地位。
为了获得良好的制片,在笔者及同事的摸索下,本室制作的染色体标本质量稳定,基本满足临床分析需要。
笔者就这一过程中的要点与大家分享,以供同行参考。
浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备2008年第2期6月出版食品工程F00DENGINEERINC浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备Onthepreparationofchromosomeofperipheralbloodlymphocyteofhumanbody董烁谢振兴(河南大学医学院,开封475004)DONGShuo'XIEZhen—xing(MedicalSchool,HenanUniversity,Kaifeng475004,China)摘要染色体制备技术是医学遗传学中最常见而重要的一种技术,由于各个实验室实验条件和个人操作手法的差异,细胞培养和染色体标本的制作方法也不尽相同.笔者就人体外周血淋巴细胞染色体的制片过程中容易出现的问题及近几年制作染色体标本总结的经验和实验方法改进进行探讨,并提出了有效的避免方法.关键词染色体;染色体制备技术;外周血;细胞培养AbstractThepreparationofchromosomeisafrequent andanimportanttechniqueinmedicalgenetics.Some problemsexistedinexperimentwereanalysed.Improvingoftheexperiments,experiencesandprecautionsduring thepreparationofchromosomeofperipheralbloodlym—phocyteofhumanbodytheseyearswerethoroughlydis-cussed.Someeffectivemethodshavebeengiveninthispaper?keywordschromosome;preparationofchromo—some;peripheralblood;cellculture染色体是组成细胞核的基本物质,是基因的载体,他由DNA和蛋白质构成,具有储存和传递遗传信息的作用.人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体.生物体细胞染色体数目和结构是重要的遗传标志之一,特别是在真核细胞中.因此深入认识染色体的结构和功能,对生物的遗传,变异和进化以及细胞的增殖,个体的发生和生殖过程的平衡控制都具有十分重要的意义.每个物种的细胞都具有一定的数目,形态,大小的染色体特征,称为染色体董烁,女,1976年出生,1999年毕业于河南师范大学,生物教育专业,助教.收稿日期:2008—03—19组型,各种染色体技术已广泛应用于核型,鉴别变异,体细胞杂交分析和绘制基因图等方面,因此在染色体的分析研究中,制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本而重要的技术,而优良的染色体制片是其他技术的先决条件.正常情况下,人外周血中是没有分裂相细胞的,只有在异常隋况下才能发现.外周血淋巴细胞一般隋况下处于增殖期中的GO(GD期,未经培养的外周血中很难找到正在分裂的淋巴细胞.植物血细胞凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在PHA作用下,能使处于GO期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞,进而进行有丝分裂.利用PHA这一特性,淋巴细胞经过含有PHA培养液培养,在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体,再用秋水仙素处理,即可获得终止于分裂中期的淋巴细胞, 进而得到所需的人体染色体图片.加之,淋巴细胞遍及全身,并在所有器官组织中不断循环,能反映个体整体水平情况而不象体细胞那样具有局部性.1细胞培养1.1无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件,也是实验成功与否的先决条件.收获细胞前的所有步骤都要保持高度的无菌,严防细菌和病毒的污染.当细胞放置于体外培养时,与体内相比细胞丢失了对生物和有毒物的防御能力,一旦被污染或自身代谢物质积累等,可导致细胞死亡.1.2恒定的温度维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.人体细胞培养的标准温度为36.5±0.5oC,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至食品工程2008年第2期6月出版死亡.如果温度高于37℃,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40℃,细胞受损,超过43℃,则导致细胞死亡.培养箱的温度应严格控制在37土0.5℃, 为了能精确有效的控温,在普通的隔水式恒温培养箱上可加装一个电子控温仪.若温度过高或过低,则会延缓分裂周期,造成收获时细胞分裂相减少.1.3气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有0和CO.CO既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,他在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.大多数细胞的适宜pH为7.2～7.4,培养基的pH值也应调整到7.2～7.4 之间,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响. 偏酸时细胞发育不良,偏碱时细胞会出现轻度固缩. 细胞培养液pH的调节最常用的为加NaHCO的方法,因为NaHCO,可供CO,但CO易于逸出,故最适用于封闭培养.1.4培养液植物凝集素(PHA)是体外淋巴细胞培养成败的关键,只有在PHA的作用下才能进入有丝分裂, 因此要考虑他的质量和尝试,质量有问题药效会降低,浓度过高可能会导致红细胞凝集,都会造成实验效果差.2操作步骤2.1细胞接种接种就是将注射器中的血液注入到培养瓶中.将注射器针头刺人培养瓶的胶塞向培养液中加入0.4mL～0.5mL血液.细胞接种通常是在无菌室超净工作台内的酒精灯火焰区进行.接种时无菌操作是否规范,直接影响到细胞培养的成败.如接种时如不慎将手接触到培养瓶的瓶塞,或接触了注射器的针头,可能会造成细菌中霉菌的污染.接种时,加入血液量的多少也会对培养结果有影响,血液太少, 细胞稀薄,细胞生长速度减慢;血液太多,会造成培养时细胞生长时营养成分不够,影响细胞生存.接种操作是在酒精灯附近进行,接种时还应注意避免血液遇高温被破坏.操作时手与酒精灯的距离以火焰不烫手为宜,离火焰太近,血细胞可能被破坏,甚至被烧焦成块,肉眼可见呈团块;同时也会造成针头堵塞.出现这种情况,应及时更换针头.如已接种,应更换一瓶培养液.2.2秋水仙素适量的秋水仙素,适当的处理时机和时间,是获得足够数量的,良好细胞分裂相的条件.分裂相的多少和染色体形态及带型处理是否良好均受其影响. 秋水仙素是一种生物碱,干扰细胞中微管组装,抵制细胞纺缍体的形成,能使细胞分裂停止于分裂中期,以积累大量的中期细胞.其浓度范围较宽,可相差几十倍之多,常用质量浓度为8g/mL~0.5g/mL.一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系, 如果在培养中,浓度过低或处理的时间过短,则标本中的分裂细胞就少,染色体瘦长;用量过多,浓度过高,虽能获得中期分裂相,但染色体缩短变粗,不利于核型分析和显带.只有浓度适量,才能确保获得中期分裂相,但染色体缩短变粗,不利于核型分析和显带.只有浓度适量,才能确保获得足够多的分裂相和长度收缩适度的染色体.另外,处理时间延长,染色体发生分离,同样使染色体变粗短,也不利于计数和分析.加秋水仙素的时间是收集细胞制备染色体前2h～3h,加入秋水仙素后,使秋水仙素的终质量浓度为0.04g/mL~0.08g/mL培养液.实验前应根据培养液的用量和秋水仙素的浓度计算出加入的剂量.通常采用的加秋水仙素的器具是容量为1mL的注射器,使用时也应注意控制好注射器活塞,避免推动时用力过猛,导致秋水仙素加入量过多.2.3收获细胞和制片收获细胞和制片包括收集细胞,低渗,固定,滴片染色等几个步骤,每一步操作失误都可能造成最后实验的失败,使玻片上观察不到染色体.2.3.1收集细胞此步骤操作不当,容易造成细胞丢失.培养瓶从恒温箱中取出时,大部分细胞都沉淀在瓶子的底部,在将培养瓶中液体吸入到离心管之前,应用吸管将细胞充分吹打均匀,再移人离心管中.离心之后,吸弃上清,也应小心操作,有时由于吸得过猛,将与上清液相接处的淋巴细胞层吸掉了,造成大量的分裂中期相细胞丢失.2.3.2低渗低渗处理是染色体制备中很重要的环节,是获得分散良好的分裂相的关键步骤,低渗时间和低渗温度都关系到制片的成功.低渗过度或不足都会造成染色体形态不良.在低渗处理时期细胞十分娇嫩,并且表面发黏,低渗细胞混匀时,吹打要适宜,避2008年第2期董烁,等:浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备6月出版27免细胞破碎及粘团,另外不要将细胞吸到吸管上部及离心管上部,避免细胞丢失.通过对比实验认为采用0.075mol,LKC137cI=处理20min一25min较合适,效果较好.用0.075mol,LKC1溶液于处理中期细胞,使细胞核膨胀破裂,染色体分散良好,便于观察计数.当低渗处理时间过长时,细胞膜过早破裂,导致分裂细胞丢失,或染色体丢失;如果低渗处理时间不足时细胞膨胀不够,则染色体分散不好,染色体仍然成团或相互重叠,不利于进行观察,计数,分析.经过低渗处理的细胞因已膨胀,容易过早破裂,造成分裂细胞丢失,所以低渗后操作应特别注意不要用力冲吸.另外低渗还可使红细胞膜破裂,经离心后,血影浮于上清液中被去除.在观察制片结果时,如发现玻片上染色体有的张不开,有的呈现团状,有的数目不够,这是由于低渗时操作不当引起的.低渗不充分,染色体聚在一起;低渗过头,染色体丢失.低渗是否能达到目的,操作时要注意两个方面:一是要使细胞充分与低渗液接触.这就需要在加入低渗液后,要充分将细胞吹打均匀;二是要注意低渗时的温度和时间.2.3.3固定固定技术也是制备良好分散的染色体的重要步骤.低渗处理完后,需加入固定液,固定的目的是对染色体形态进行固定.若染色体分散不良,可适当加大冰乙酸含量,其同时有改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷,但过量会造成染色体形态变化和影响分带结果.染色体形态不良与加固定液速度有关,加第一次固定液快或过快,可造成飘带样染色体.固定液每次使用必须新鲜配制,否则将会形成酯类,从而影响固定效果.如果固定液不新鲜或甲醇,冰醋酸的质量不佳时,染色体形象模糊,染色体周围有胞浆背景,固定液为分析纯的甲醇和冰醋酸按3:1的体积比配制.预固定和固定时间:加固定液时,应沿管壁慢慢加入并轻轻吹打均匀,预固定和以后的二,三次固定时,固定液加入太快,混匀太快,会使固定作用过强,染色体扭转;固定作用若不足,染色体出现毛刷状.固定液纯度要高,临时配制,固定后再彻底打匀.吹打细胞时,用力要适度,如吹打过重, 会导致核型中染色体的丢失或变形.采用甲醇和冰醋酸按3:1体积比的固定液进行固定,将常用的第一次固定时间5min,30min改为25min,20min,适当延长时间,固定效果较理想.2.3.4滴片滴片是染色体制备中影响染色体形态的关键一步.首先是载玻片要非常干净,否则会影响染色体的分散和分带效果.滴片用的玻片应干净,无脂,无酸才行.其次是滴片的距离,滴加量多少,制片的方式都会影响染色体分散效果.如果冰片冷冻不够,细胞难以贴附而造成丢失.载玻片经过一系列处理擦干后,放置冰箱内,冰冻4h以上,即为冰片.滴片时现用现拿出,否则会融化,操作时采用0℃预冷的冰片滴片.滴片时导致实验失败的原因有以下几方面:①由于细胞悬液太稀,导致滴片时细胞稀少;②载玻片上水太多,导致细胞悬液顺着水流失;③载玻片不洁净,染色体分散不佳;④滴片后,应立即放入7OcI=的烤箱中,以利于细胞的进一步胀开. Giemsa染色液与pH的影响:染色液浓度高,染色时间应缩短,如果染色液浓度增高,染色时间又延长,染色体着色加深,形态结构不清,对裂隙, 染色体断裂的检出可能减少.pH偏碱,染色体着色发蓝,色泽不艳,pH稍酸,染色体呈玫瑰色,色调鲜艳,形态结构清晰,利于统计分析和畸变的检出.烤片是染色体制备中最后一步技术.烤片的温度,时间与染色体形态和分带有关.不宜温度过高和烤片时间过长.细胞培养和染色体制备实验从接种到制片长达76h,在整个实验过程中必须严谨,不能有任何差错.而且细胞培养实验不同于其他实验,步骤多,整体性强,操作要求严格认真,最终实验才会取得成功.总之,随着医学的发展及人们对遗传疾病的逐步认识,染色体制备技术现已是医学遗传学中最常见而重要的一种技术.作为一名技术人员,做出一张高质量的人体外周血淋巴细胞染色体标本是十分重要的,这样才能更好地为临床诊断及优生与遗传咨询工作服务.参考文献[1]左假.医学遗传学[M],北京:人民卫生出版社.2004:110-127.[2]周焕庚.人类染色体[M].北京:科学出版社.1987:85—86.[3]蔡绍京.细胞生物学与医学遗传实验指南[M].上海:第二军医大出版社,2002:47_48.。
外周血染色体制备及分析原理：人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。
外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色体标本。
由于整个培养过程操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量，培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间，预固定、固定的时间以至制片时的温度和湿度等.本实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下：一、试剂准备1、0.2%的肝素溶液2、0.0005%秋水酰胺溶液（黑色纸包裹避光置4℃冰箱保存）3、0.075mol/Ll氯化钾溶液4、3：1甲醇冰醋酸溶液（固定液，临用前配制）5、10%Giemsa染色液（将Giemsa原液临用前用PH7.4的磷酸缓冲液即PBS新鲜配制）二、采血与培养取外周血淋巴细胞培养基(RPMI1640)室温复融，并标记姓名、编号，每例标本接种2瓶，肝素湿润的无菌注射器采取静脉血1-2ml，于每瓶接种0.3-0.5ml。
置37℃培养箱内培养72小时。
每日早晚定时摇匀培养物1次。
收获细胞前2小时，用5号针头加入10ug/ml秋水仙素2-3滴，（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.1ug/ml左右）。
摇匀后继续培养 2小时。
三、收获细胞培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入10ml刻度离心管中，标记姓名、编号，以1000转/分钟，离心10分钟后弃上清。
1低渗处理：向离心管中加入6-8ml事先预温（37℃）的0.075mol/L Kcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中,放回37℃恒温水浴箱（或培养箱）中，静置15-20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。
2、预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）1ml，轻轻混匀。
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析学院：生命科学学院专业：生物科学年级班级：2010级5班校区编码：北区姓名：陈建坤二零一二年十二月四日人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。
本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。
该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。
经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。
最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。
【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养一．引言:染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。
人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。
染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。
1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。
1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。
之后，有科学家建立了人体外周血培养法，使得染色体取材变得更加容易，大大推动了人类对染色体的研究。
二．人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析1.实验依据：.细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析报告生命科学学院09级四班二组组长：傅盛晟其他组员：范方超，曹熙在，陈良婷，母进，刘玉梅，刘天娥提要：探讨一种一般实验室能够开展的方便稳定的染色体制作方法。
方法用1640培养基在37℃恒温培养箱中无菌培养人体外周血淋巴细胞72h, 在细胞进行到分裂高峰的中期加入秋水仙素终止液, 经过低渗、固定、玻片处理、滴片、核型分析等一系列过程,制作出染色体标本。
结果制作出较多优良的分裂相及清晰可辨的染色体。
本法在一般实验室条件下即可制作出人体外周血染色体。
关键词：淋巴细胞，培养，染色体，核型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
2、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L 的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体装片。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。
染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。
根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。
表1 人染色体组型及其特征组别染色体序号形态，大小着丝点位置次缢痕随体A 1~3 最大中部着丝粒（1，3）亚中部着丝粒（2）1号染色体B 4~5 次大亚中部着丝粒C 6~12X 中等亚中部着丝粒9号染色体D 13~15 中等近端着丝粒有E 16~18 小中部着丝粒亚中部着丝粒16号染色体F 19~20 次小中部着丝粒G 21~22Y 最小近端着丝粒有三、实验试剂与器材培养基：RPMI1640, 按照说明书配制后抽滤、分装，冻存备用。
RDW 均增大,属不均一性大细胞贫血,红细胞巨幼样变。
红细胞指标M CV 、M CH 、H CHC 的测定是进行形态学分类的依据,过去把贫血分为大细胞、正细胞正色素、小细胞低色素、单纯小细胞4个类型,此法忽视了红细胞体积的异质性对指标准确性的影响,不能全面反映红细胞的病理变化。
笔者认为,M CV 及R DW 测定结合了红细胞形态学分类,可得到较可靠的初步诊断意见,进而做特殊检查可明确诊断。
M CV 、RDW 对缺铁性贫血与巨幼红细胞性贫血有较好的诊断价值,可作为一种快速、简单、方便、准确的筛选方法。
参考文献[1]丛玉隆.今日临床检验学[M].北京:中国科学技术出版社,1997:9.(收稿日期:2010-12-16)v通讯作者,E -mail:zh anggu oyuan9826@sin 。
#经验交流#外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会马 强,刘青松,蔡 燕,邢 艳,张国元v(川北医学院附属医院检验科,四川南充637000)摘 要:目的 总结该室外周血淋巴细胞培养及染色体制备的成功经验,供同行参考与借鉴。
方法 采用外周血淋巴细胞培养基接种外周全血,按照常规方法制作染色体标本,进行镜检。
结果 该室培养的淋巴细胞数量稳定,染色体核型质量佳。
结论 该室制作的染色体标本质量能满足临床染色体核型分析需要。
关键词:染色体; 外周血; 淋巴细胞DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2011.14.061文献标识码:B 文章编号:1673-4130(2011)14-1641-02 染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施,对优生优育工作有着重大意义[1]。
然而,染色体制备过程缺乏有效的质量控制,经验在染色体标本制备过程中占有重要的地位。
为了获得良好的制片,在笔者及同事的摸索下,本室制作的染色体标本质量稳定,基本满足临床分析需要。
笔者就这一过程中的要点与大家分享,以供同行参考。
1 淋巴细胞培养1.1 外周血采集 一般情况下,在采集外周血时,采用5mL 空针吸取0.5mL 左右无菌肝素作为抗凝剂,再采集患者外周静脉血。
然而,在当今复杂的医疗环境下,这样的操作可能会给患者带来不符合操作规范的感觉。
为了避免不必要的医疗纠纷,本室采用动脉血气针(BD 公司生产)抽取2~3mL 外周静脉血,备用。
在操作过程中要始终保持无菌观念,用碘酒和乙醇消毒皮肤,自肘静脉采血,然后要把注射器内的血液充分轻轻混匀,以防止血液凝固,影响细胞培养质量[2]。
1.2 接种 培养基的质量在影响染色体质量方面最为关键,从营养不良的培养基中获得的细胞所制备的染色体质量差,不利于染色体核型分析。
本室采用湖南湘雅基因技术有限公司生产的成品外周血淋巴细胞培养基(5mL ),只需将采集的外周血接种适量在培养基中,摇匀后置入CO 2孵箱中培养即可。
接种时,若血液过少,获得的淋巴细胞少;而接种过多,淋巴细胞增殖不良,染色体稀少。
经过摸索,发现成年人接种血气针采集的血液20~25滴为宜,4岁以下儿童接种15~20滴为宜,新生儿则只需8~10滴。
1.3 细胞培养 细胞培养阶段也是极为关键的一步,细胞的旺盛生长与培养时间、温度、CO 2浓度等条件。
1.3.1 培养时间 经过试验,分别取培养24、(48?2)、(72?2)、(96?2)h 的培养物分离淋巴细胞,制片,核型分析后发现:培养24h 者几乎见不到分裂象;培养(48?2)h 者,每张制片上可见中期分裂象小于10个,且染色体质量差;培养(72?2)h 者,每张制片上分裂象大于200个,染色体质量佳;而培养96h 者,其质量与培养(48?2)h 者相差无几。
因此,本室培养细胞的时间控制在72h 左右,制作出的染色体核型佳,有利于分析。
1.3.2 培养温度与气体 淋巴细胞培养的适宜温度为(36.5?0.5)e ,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。
如果温度高于37e ,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40e ,细胞受损,超过43e ,则导致细胞死亡。
气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有O 2、CO 2。
CO 2既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。
大多数细胞的适宜pH 为7.2~7.4,培养基的pH 值也应调整到7.2~7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。
偏酸性时细胞发育不良,偏碱性时细胞会出现轻度固缩[3]。
培养箱的温度和CO 2浓度应严格控制在(37?0.5)e 、5%以获得良好的中期分裂象。
2 细胞收获2.1 秋水仙素与作用时间 秋水仙素作为细胞培养中的纺锤体阻断剂,可使分裂象细胞停留在分裂中期而获得大量分裂中期染色体以便于核型分析。
加入秋水仙素的剂量、作用时间与处于分裂中期细胞数量、染色体长短密切相关。
加入的秋水仙素过量、作用时间过长,染色体浓缩,不利于分析;若加入的秋水仙素量不足、作用时间过短,则染色体细长或无染色体,同样不利于核型分析。
只有适量的秋水仙素与适量的作用时间,才能获得较好的分裂象。
本室加入秋水仙素使最终浓度为0.025%,作用1~1.5h 可获得数量多、浓缩程度适中的染色体。
2.2 离心力 将培养物收集到15mL 的离心管中,通过离心获得需要的细胞。
整个过程中,离心力的大小很关键。
离心力过大会导致细胞之间粘连过紧,低渗时细胞不能被充分混匀,影响低渗效果。
这一步本室选择1900r /min 离心10min 。
而低渗过后预固定与固定过程中,去除固定液时由于细胞少,过小的离心力不能将细胞充分沉淀。
为了尽可能的获得多的细胞,本室采用2500~3000r/min 离心10min 。
此外,在去除上清液的时候不要将上清液吸尽,以免造成细胞丢失。
2.3 低渗 低渗的目的是让水分进入细胞,使细胞肿胀、破裂,是染色体制备过程中的关键环节之一。
低渗液渗透压过低、低渗时间过长会使核膜破裂,染色体提前释放,这不仅会使分裂中期细胞减少,散在的染色体也会在滴片过程中随机分布在载玻片上,影响其他细胞的染色体计数,降低制片质量;低渗时间过短,一部分细胞的细胞膜未破裂,导致染色体释放障碍,同样不利于核型分析。
本室采用常规的0.075mo l/L K Cl溶液8mL,低渗(30?5)min,可获得足够数量的分裂中期细胞。
3固定收集细胞过程中加入固定剂的目的是维持染色体的形态。
一般实验室使用的都是按甲醇B冰乙酸=3B1比例配制的混合液。
一方面,固定剂可以使细胞脱水、蛋白质变性而使染色体变得粗大并适中;另一方面,有机溶液可以让红细胞破裂,通过离心可以获得比较纯净的淋巴细胞。
固定液需新鲜配制,主要是由于固定液所含的水分和固定效果有关。
另外,可以适当增加冰乙酸的比例来达到良好的效果[4]。
4制片与烤片4.1细胞悬液配制经过低渗、预固定、固定,即获得淋巴细胞。
此时的细胞非常脆弱,在配制细胞悬液时要轻轻地吹打混匀,吹打方式或者力量不当,都会使核膜破裂,造成染色体释放。
此外,细胞悬液的浊度也要适中,悬液浊度太小,制片后载玻片上细胞数量少;浊度太大也不利于染色体分散,染色体交叉,均不利于分析。
4.2滴片滴片质量的好坏也是染色体制作的关键步骤之一。
在制片时,载玻片的清洁度将直接影响细胞的贴附能力。
因此,在制片前,载玻片要经泡酸处理,以清除载玻片上的阴阳离子与杂质。
适当的滴片高度也是获得高质量染色体的必然要求。
高度过高,染色体分散范围过大,甚至造成染色体丢失;高度过低,则染色体分散不良。
经过探索,本室滴片的高度保持在8~15cm,能获得比较好的分裂象。
4.3烤片烤片温度的高低和时间的长短会影响显带标本的质量,掌握好适宜的烤片温度和时间,才能制备高质量的显带标本[5]。
烤片温度过高、时间过长,胰酶对标本的消化时间也随之增加,这既影响工作效率,也影响标本的显带质量,使显带达不到最佳效果。
烤片温度过低、时间过短,标本的老化程度不够,不能很好地把握胰酶消化的时间,导致消化不足或过度。
所以,适当的烤片时间和温度也是获得高质量染色体的必然要求。
本室采用72e烤片1.5~2h,可获得质量优良的标本。
5消化与染色5.1消化G显带标本是临床上运用最多的显带技术。
无论细胞培养、制片、烤片过程做得多么完美,如果没有很好地把握消化与染色过程,也不能获得显带清晰的染色体。
消化过程是去除染色体上的蛋白质(包括组蛋白和非组蛋白)而获得良好的显带标本,通常用的消化酶为0.025%的胰蛋白酶。
然而,消化时间根据胰酶的浓度、质量不同而定,不同的实验室消化时间不一,即使同一实验室不同时间消化所需的时间也不同。
这就要求实验人员在每次批量消化之前都要进行条件摸索,以获得最佳的实验条件。
5.2染色G显带用的染液为姬母萨染液,既可以自己配制,也可以购买商品化的试剂。
染色体制作本身是一个受多因素的影响过程,染液的质量也会影响染色体的着色。
本室购买的湖南湘雅基因技术有限公司的商品化的姬姆萨染液,具有方便、质量稳定的优点。
由于放置过久的姬姆萨染液有效成分会下沉,用之前需摇匀,才能获得质量良好的制片。
另外,姬姆萨染液对稀释液的pH值也有一定的要求,本室采用pH7.4的PBS作为稀释液,即可获得清晰的染色体图像。
目前,染色体制作过程没有统一的质量控制,试剂生产厂家多,且质量也参差不齐,各实验室制作的染色体质量与实验环境、试剂质量、人员素质均有很大的关系。
为了尽可能的获得稳定的染色体标本,各实验室应该参考其他实验室的成功经验,根据自己实验室条件进行摸索,以获得质量尽可能高的染色体标本。
参考文献[1]朱丽萍,施东华.出生缺陷与产前诊断[J].中国优生与遗传杂志,2002,10(1):12-15.[2]曹海涛.染色体外周血淋巴细胞培养中的几点体会[J].现代中西医结合杂志,2007,16(30):4485.[3]董烁,谢振兴.浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备[J].食品工程,2008(2):25-27.[4]慕明涛,霍满鹏,蒲力群,等.人外周血染色体标本制备失败的影响因素分析[J].延安大学学报:医学科学版,2007,5(4):3-4. [5]赵小平,余红,黄燕,等.烤片对染色体G显带标本质量的影响分析[J].现代医药卫生,2009,25(3):393.(收稿日期:2011-01-27)#经验交流#白细胞计数正常的脑脊液中检出肿瘤细胞病例回顾性分析万均成,文芳,肖玲(武汉大学人民医院神经精神病研究所430060)摘要:目的回顾并探讨白细胞计数正常的脑脊液(CSF)在分类计数中检出肿瘤细胞及其对脑膜癌的诊断价值。
方法用血球计数板计数CSF中的白细胞数,再用玻片离心法收集细胞,瑞-姬染色,镜检。
结果9例患者CSF白细胞计数均小于10个/微升。
