菌种分离的方法

细菌的分离与培养

实验目的：

掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。

实验材料：

菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。

实验内容：

一、平板划线接种法（分离培养法）

原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。

用途： 分离出纯种细菌，以利作纯培养。

课时安排：2课时

操作方法（三区划线法）：

1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。

2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。

3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。

4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。

5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。

二、液体培养基接种法

用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。

操作方法：

右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。

1、 左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。

2、 将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。

工业微生物菌种的分离与筛选

来源：青岛海博

一、微生物工业对菌种的要求

（一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定:生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。

（二）、微生物工业对菌种的要求是：

(1)菌株高产,在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力；

（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物；

（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力；

（4)能够高效地将原理转化为产品;

（5）能利用广泛的原材料,并对发酵原料成分的波动敏感性小；

（6)对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用；

（7）在发酵过程中产生的泡沫要少;

（8)具有抗噬菌体的能力；

（9）遗传稳定性,

二、工业用微生物菌种的来源及选育

（一）微生物菌种的来源

一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：

（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；

（2)从大自然中采集样品分离；

（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。

当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。

(二)微生物工业菌种的分离

1、野生菌株的分离、筛选过程

（1)新菌种分离与筛选的步骤

菌种分离的流程如下:

标本采集 →标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→ 菌种复筛→性能鉴定→ 菌种保藏

①采样

采样季节：以温度适中,雨量不多的秋初为好.

采土方式：在选好适当地点后,用小铲子除去表土，取离地面5—15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。

②标本预处理

④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。

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授课：XXX 原始菌种分离自野生材料或栽培材料。

一般用野生或栽培果(子实体),也可用干子实体来进行分离,干子实体作菌料的成活率及子实体产量均比新鲜子实体作分离菌种的材更高。栽培子实体达到商业化采收标准时一般还没有成熟和子囊孢子也都未完全成熟;孢子分离需要将子囊孢子培养到完熟的状态,子实体已经倾斜或快要倒伏,外观形态表现为子囊果面有白色、灰白色的孢子粉出现时比较可靠。野生子实体成熟比较很小的子实体就已经形成了孢子,容易获得大量孢子粉。

种菇的选择：选择菇形正常,菌盖圆整,顶端较尖,尖顶凸起完整,菌柄圆正,菌柄短而结实,大小适中,无虫害、霉变或杂菌感染的子实体,鲜品或干品均可。

种菇的采集：菌柄基部最好带少量土壤一起采集,用吸水纸包裹3层,再用报纸包裹,低温下带回实验室。不要把菌柄基部剪掉留下空心的子实体进行分离新鲜子实体采集后放在室内桌面或吸水纸上自然晾,稍稍除去部分水分,若采集地点离实验室很远或工作时间较长,可以晾干到子实体含水量在15%以下。标本用吸水纸包,再用报纸包裹,带回实将未成熟的栽培子实体采集后,可以放在室内假植几离。

方法是移栽在盐内湿上上,培养儿天直到有子弹射为止,以便集孢于注意一般不要把标本放入塑料袋内运送,也绝对不能用烘干的办法处理需要分离的标本。如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载!

授课：XXX 菌种分离一般不要采用传统教科书所叙述的方法,传统的方法都容易导致污染和不生长。为此本专著为大家特别介绍了下列的新方法。

常见的分离方法有：纯组织分离法,分别有菌盖组织、菌柄组织,菌盖菌柄结合部位组织、组孢混合分离法、膨大细胞分离法、纯多孢分离法、单孢分离法等等。其中,上内菌丝分离比较困难。

纯组织分离法：采野生或栽培的幼嫩体,用无菌吸水纸包裹,放于无菌纸袋内。0~4℃冰瓶保存。送到实验室,放在无菌培养皿内,在超净工作外线照射20min,具体可以采用悬挂法、断斜面法。

菌种分离思路：  菌种筛选方案 ： [1] 初筛：目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。 [2] 复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。  菌种筛选的手段 [1] 初筛 [2] 从菌体形态变异分析 [3] 平皿快速检测法： 具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等 [4] 摇瓶培养法： 初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。 土中细菌的富集培养与分离 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。 富集方法： 运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。富集可以促进抗性的产生并维持下来。 土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。 植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。 水中细菌的分离：水样通过0.22μm无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。 水中细菌分离的简易富集技术： (1) 在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上； (2) 在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。 (3) 培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 (4) 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。 (5) 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。 次代培养及纯化步骤： 1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。 2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。 3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。 4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。 放线菌的分离 土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。 植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。 水中放线菌的分离： 为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。 次代培养及纯化 菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。 通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。 成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。 将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。 真菌分离 1、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。 2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。 3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。 4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。 富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。 5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。 真菌的分离方法 土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。 植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。 水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。 子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。以下根据好氧菌特征和厌氧菌特征进行