菌种分离与培养

菌种分离与培养（1）

人们采取无菌操作的方法，把某种食用菌从混杂的微生物中，单独地分离开来，这个过

程叫做菌种分离。从分离过程中得到的菌丝体纯化后，就是纯菌种。在实验室条件下，以人工使纯菌种大量生长和繁殖的方法，叫做培养。

一、母种培养

(一)菌种分离

菌种分离通常采用的方法有孢子分离法、组织分离法和寄主分离三种方法，三种方法各

有特点，可根据不同的菌类和生产条件选择使用。 1.孢子分离法 孢子分离法，是利用成熟子实体的有性孢子能自动从子实体层中弹射出

来的特性，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，而获得纯种的一种方法。

(1)孢子的采集

①种菇的选择 用作分离菌种的种菇，应选择出菇早、朵型好、个体肥大、生长健壮、

无病虫害、八成熟的菇体。一进入出菇期，就要注意观察选择，并作好标记。不同的食用菌选择的具体要求是：

香菇 菇型圆整，菇体肥大，柄细而短，菌盖呈深褐色，出菇早，无病虫害，一般为八

成熟的子实体。

双孢蘑菇 菇型圆整，光滑直立，颜色洁白，柄粗盖厚，无病虫害，生长快而健壮的单

生菇。 草菇 菇型端正，肥大健壮，包被未破，无病虫害的单生菇。

平菇 出菇早，菌盖厚实，重叠丛生，菌柄粗短，色泽鲜亮，尚未散发孢子，八成熟而

无病虫害的子实体。

木耳 选朵大、耳片厚、色黑、生长健壮、褶皱多、无病虫害的春耳。

银耳 朵大肉肥、色泽洁白、展片良好、朵型美观、八成熟、无病虫害的子实体。 猴头 形状正常、颜色洁白、出菇早、生长健壮、菌刺丰满、无病虫害的子实体。

金针菇 出菇早而均匀、生长健壮、朵型正常、菌柄长短适中、无病虫害的子实体。

②种菇的消毒 子实体采回后要及时切除基部，并进行表面消毒。对子实体层未外露

的种菇(如蘑菇等)，可浸入0.1%升汞溶液中消毒约1分钟，用镊子捏出后经无菌水冲洗数次，

再用无菌纱布将表面水吸干；对于子实层裸露的种菇(如香菇等)，只能用75%酒精揩擦菌盖及菌柄表面；而对于银耳、木耳类子实体，却千万不能接触消毒剂，只能置于烧杯中用无菌

水洗涤，然后捏起再经无菌水冲洗数次，同样用无菌纱布吸干表面水。

种菇(耳)经消毒处理后即可采集孢子。在采集前，事先要备好孢子收集器和接种箱，将

孢子采集器放入消毒锅内以1.5kg/cm2的压力灭菌1小时，然后取出放入已消毒的接种箱内

备用。 ③采集孢子的方法 根据具体情况，采用下列方法进行孢子采集。

整菇插种法：适用于伞菌类的孢子采集。在接种室(箱)中，将经消毒处理的整只种菇插

入无菌孢子收集器里，再将孢子收集器置适温下让其自然弹射孢子(图4—8)。待孢子下落后，

将孢子收集器移至无菌室(箱)中，打开钟罩，拿去种菇和支架，将培养皿盖好，并用透明胶

纸或胶布封贴保存。 三角瓶钩悬法：适用于不具菌柄的子实体

(如木耳、银耳等)孢子的采集。即在无菌室(箱内)，将耳片用无菌水洗涤，无菌纱布吸

干，取一个事先准备好的金属两头钩，经火焰灭菌后一端钩住耳片，另一端钩在三角瓶口上(瓶

内装有1cm厚经灭菌的PDA培养基)，加棉塞(图4—9)，置室温下培养1～2天，见培养基表

面有一层白色孢子印时，即可移入无菌室(箱)里，取出钩子和耳片，仍塞好棉塞保存备用。 菌褶涂抹法：在接种室(箱)内，取消毒好的菌盖，用经火焰灭菌的接种环，沾上无菌水后准确地直插在两片菌褶之间(切勿使接种环接触到裸露于空气间的菌褶部分，以免粘上杂

菌)。轻轻地抹取子实层，将尚未弹射的孢子沾在接种环上，取出接种环，在准备好的斜面培

养基上或平板培养基上划线接种，加棉花塞或盖上平皿。此法在野外采种时尤为方便，但仍要无菌操作，且动作要准确、敏捷。

空中孢子捕捉法：凤尾菇、平菇、香菇等伞菌子实体成熟后，大量的孢子会自动弹射出

来，在子实体周围用肉眼可见烟雾状的“孢子云”，此时迅速将事先制备好的培养基平板或试

管口面迎“孢子云”方向，使孢子附着在培养基表面，随即盖上皿盖或加棉塞即可。

菌种分离与培养（2）

(2)孢子的分离

①单孢分离法 是将采集到的孢子单个分开进行培养，让它单独萌发成菌丝而获得纯种

的方法。在目前已驯化栽培的食用菌中，蘑菇和草菇等同宗结合型的食用菌，由单孢子培养的菌丝，经双核化后形成的双核菌丝体，一般都具有结实能力，因此可以采用单孢分离法来

生产纯菌种。其他的一些食用菌类，如香菇、平菇、金针菇、凤尾菇、毛木耳等异宗结合型

食用菌，其孢子具有性别，单个孢子萌发的菌丝无结实能力，必须通过不同性别的单孢子间

的结合，才能结实。因此，单孢分离法直接在生产上应用不多，但它却是研究食用菌生物学

特性和遗传育种的一项重要技术。 单孢分离技术包括稀释分离法、平板划线分离法、器械分离法和毛细管法。现主要介绍

稀释分离法，其具体操作过程如下：

制备无菌水试管 取5支试管，其中1支装10mL蒸馏水，4支各装9mL蒸馏水，经高压

灭菌即成无菌水。

制孢子悬浮液 取一接种勺孢子粉，置于10mL无菌水试管中，摇振使孢子分散成悬浮液；用无菌注射器或1lmL的吸管，吸取1mL孢子悬浮液于第2支试管中，摇振使其分散；再从第

2支试管中吸取1mL注入第3支试管„„如此直至稀释到第5支试管，并取第5支试管稀释

液在显微镜下检查，如果孢子是单个的，说明已达稀释目的，否则还须继续稀释。 制培

养基平板将琼脂培养基融化至60℃，倒入平皿(直径9cm的培养皿注入15mL即可)，待冷却

至45℃左右时，另取2支无菌注射器或吸管，从第4，5支试管中各吸取孢子液0.2mL，分别注入平皿中(每种浓度各接3～4个平板)，与培养基充分摇匀，待凝固后倒置于25℃恒温箱

中培养。

挑单个菌落培养纯种 在培养期间，每天要取出观察，严格挑选发育匀称、生长快速的

单个菌落，移入新斜面培养基上进行培养即为纯种；如系异宗结合的菌类，则要同时挑选能

生育的一对单菌落。 ②多孢分离法 就是把许多孢子接种在同一培养基上，让其萌发，自由交配，从而获得

纯种的方法。此法简便易行，在食用菌制种中应用较为普遍。常用的方法有以下几种：

直接培养法 将采集到孢子的接收器(装有琼脂培养基的试管或平皿)，直接置恒温箱中

培养，待孢子萌发后挑选特征典型的菌落，再转接培养成母种。

斜面划线法 按无菌操作规程，用无菌接种针沾取少量孢子，在PDA试管斜面培养基上自下而上划线，划线时勿用力，以免划破培养基表面。接种完毕，抽出接种环，灼烧管口，

塞上棉塞。按照各菌种的菌丝生长温度要求，置恒温下培养。待孢子萌发后，挑选萌发早，

长势旺的菌落，转接于新试管培养基上再行培养即成母种。

涂布分离法 用接种环挑取少许孢子至装有无菌水的试管中，充分摇匀制成孢子悬浮液，

然后用经灭菌的注射器滴管，吸取孢子悬浮液，滴1～2滴于试管斜面或平板培养基上，转动试管使孢子悬浮液均匀分布于斜面上，或用玻璃利刀将平板上的悬浮液涂布均匀。孢子经恒温培养萌发后，挑选几株发育匀称、生长快速的菌落，移接于另一试管斜面培养基上，恒温

培养即成母种。

以上几种多孢分离培养的方法，仅从菌丝生长情况、菌落形态等外部特征进行鉴别，还不能作为菌种优劣最后的根据。为了保证母种的质量，还需要作生物学鉴定，即进行出菇试

验，根据其生物学特性和生物学效应等数据，才能确定是否能应用于生产。

菌种分离与培养（3）

2.组织分离法 是利用子实体组织来分离获得纯菌丝的方法。食用菌的子实体实际上是

菌丝体的扭结物，具有很强的再生能力，通过菇体组织分离，培养纯种，此种方法简便，取材广泛，不易发生变异，又能保持种性，无论幼菇或成熟菇体，只要是新鲜的，均能分离培

养。

(1)香菇、平菇组织分离法 香菇、平菇组织分离时，首先应从出菇早、结菇均匀、生长

旺盛的菇木上或菌砖上，挑选发育正常，菇蕾长出不久，边缘尚内卷，菇柄短壮，菇盖肥厚，

无病虫害的种菇作分离材料。 分离时，将采好的种菇用清水洗净表面，然后带入无菌室(箱)内，放入0.2%升汞水或75%

的酒精内浸泡分钟，取出用无菌水冲洗1～2次，用无菌纱布吸干水渍，放入清洁的培养皿内，

用消毒过的小刀把菇蕾纵剖为二，在菇盖与菇柄相接处的部分切取绿豆大小 菌肉（图4-10），

移接在斜面培养基中央。

试管接种后放入25℃～27℃恒温下培养2～3天，组织块上就长出白色的菌丝，15天后，菌丝就可以长满培养基斜面。再移接到新的培养基上培育成母种。

（2）黑木耳的组织分离法 由于黑木耳的耳瓣薄，并富有胶质，所以在过去的分离法中

很少采用耳片组织分离。其实采取组织分离法，操作容易，方法简便，只要消毒操作严格，

分离极易成功。在自然气温下干燥的，贮放期在6个月内的干种耳，分离后均能长出菌丝体。

具体操作：先将干耳浸水6～8小时，然后用冷开水冲洗2～3次，再用清洁纱布或药棉吸干渍水，带入接种箱内，在无菌水中摇动4～5分钟，取出用75%酒精擦洗表面，用无菌水

冲洗多次，再将耳片用无菌剪刀将四周边缘去掉，切取0.lcm左右的组织块，接种在试管中

部培养基边壁上，以利长出菌丝，接种后放入28℃～300℃的恒温下培养1～2天后，就可看

到白色绒毛状菌丝，初期生长较慢，5～6天后生长迅速，1.5天左右就可长满全管。

(3)其它菌类组织分离法 草菇、猴头、灵芝、茯苓等组织分离法操作程序和消毒方法与香菇组织分离相似，培养温度因种类不同各有差异。

草菇选择外形端正、健壮肥大、包皮未破的菌蛋作分离材料，取菌柄与菌伞连接处的组

织，接到试管培养基后，放在30℃～33℃温度下培养。

猴头组织分离法首先应选肥大、幼嫩、刺短，生长健壮的子实体，然后用清水洗净表面，

将外表菌刺削去后按香菇组织分离操作进行消毒，用无菌解剖刀在子实体上划一条缝用手沿缝掰开，挑起心部小块组织移入斜面培养基中，置于20℃～22℃温度下培养。灵芝的组织分

离也是取菌柄与菌盖连接处的小块组织，接种后的培养温度在25℃左右。

茯苓是采用菌核分离，首先应选择个体大而结实，生长旺盛，表面可见裂纹，颜色为紫

红褐色，皮薄，肉色白，掰开后可见细小的乳白色或绿豆浆色的浆液，重达1.5kg以上的鲜

菌核作为分离材料，所取组织块相对要大点。试管接好后,置于22℃的恒温下培养。为了防止菌种退化。最好各品种每年用组织分离重新分离一次，以确保菌种质量的优良。

3.寄主分离法 寄主分离法是从生长有菇耳的木材中获得纯种的一种方法，也叫种木分

离法。常用于黑木耳和银耳的菌种分离。

(1)黑木耳的寄主分离法 黑木耳的耳木分离应在盛产子实体的季节进行。选择经自然孢

子繁殖的，结耳多、耳片大、无杂菌和病虫害的耳棒；或选择人工接种在1～2年内出耳，出耳旺盛，朵形大的耳棒做分离材料。