菌种分离法

实验六 平板划线法分离菌种

一、实验目的

1、了解平板划线法分离菌种的基本原理

2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术

二、实验原理

平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。

平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。

具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。

鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数）

其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。

分离羊肚菌菌种方法

本技术的目的在于提供一种不用消毒剂，既容易萌发，同时也能降低污染，并能较顺利的分离到羊肚菌菌种的分离羊肚菌菌种方法。

为了实现上述目的，本技术方案采用了一种分离羊肚菌菌种的方法，包括以下步骤:将胶带封闭的羊肚菌用75%消毒酒精均匀擦拭后，用烧灼的刀具从菌柄顶端在

火焰上方切割掉子实体头部，露出的新鲜菌柄横切面，在火焰上轻快过2-4下，用刀具在新鲜菌柄内侧环割菌柄新鲜菌肉组织并送入抗生素平板培养荃上，于20-30℃的温度下培养，待萌发出菌丝后，及时转接。

所述的刀具为手术刀片。

羊肚菌子实体在切割前要基部菌柄完整，用透明胶把羊肚菌整个缠绕密封，中间

不留空隙。

所述的抗生素平板培养基为:马铃薯400g,草炭l00g,葡萄糖20g，磷酸二氢钾lg,

硫酸镁0. 5g,酵母膏50g，琼脂20g、水1000mL,链霉素30U/mL，青霉素30U/mL,

pH6.5

所述抗生素平板培养基的制作方法为:土豆削皮切薄皮加3000m1.水煮30min，过

滤 取2000mL，加入草炭，小火浸煮20min，过滤取滤液1000mL，在此滤液中加入葡萄糖、酵母膏、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁，小火煮至琼脂溶解， 定容至1000mL，分装于三角瓶，在高温121℃-126'C,高压0. 1-0. 14MPa灭菌30min。待冷却至50℃左右加入青霉素钠、硫酸链霉素复合抗生素母液，使抗生素终浓度在30U/ml.左右，将配好的培养基倒入培养皿 中或直接冷却成固体培养基。

本技术的分离方法，先是对羊肚菌进行封闭式消毒，防止消毒酒精浸入菌组织，有利分离成功。另外，割掉子实体头部后，露出的菌柄内侧为无菌组织，环割取内侧 菌肉组织防杂效果较好。采用抗生素培养基也有利于防止杂菌污染，培养基的组分营养非常全面，特别是加入草炭和酵母膏，为羊肚菌菌丝生长提供了保证。本发明 的整个操作过程不用消毒液，全用火焰消毒，萌发率较高，既保证了容易萌发，同时也能降低污染，并能较顺利的分离到羊肚菌菌种。

1 项目二、白酒生产原料、半成品及成品检测

一、选择题。

1、酒精的硫酸试验下列因素对测试结果影响较小的是( )。

（A）加入优级纯硫酸的质量 （B）加热火力的大小

（C）振摇的方式与快慢 （D）色度标准液密封保存已5个月

2、下列因素中影响酒精度两次测定值之差最大的可能是( )。

（A）样品的吸取差异 （B）蒸馏时冷却水温度差异

（C）测定密度时的温度差异 （D）测定密度时前后时间差异

3.郎勃-比尔定律，A=KCL中K与（ ）有关。

A、吸光物质的性质及入射光波长有关 B、K=cLA，与吸光度溶液浓度及液层厚度有关

C、与吸光无知的酸度有关 D、与测定仪器有关

4.酸度计组成中下面不可缺少的是（ ）。

A、精密电流计、电极 B、精密PH计、电极

C、精电阻计、电极 D、精密电位计、电极

5.当用标准碱液滴定氨基酸时（用酚酞作指示剂），常在氨基酸中加入（ ）。

A、乙醇 B、甲醛 C、甲醇 D、丙醇

6.下列分析方法不属于仪器分析的是（ ）。

A、光度分析 B、电化学分析 C、色谱法 D、化学沉淀称重法

7.下列测定方法中不能用于食品中铅的测定的是（ ）。

A、双硫腙光度法 B、火焰原子吸收光谱法 C、硼氢化物还原光度法 D、石墨炉原子吸收法

8.白酒甲醇的亚硝酸品红比色测定操作，下面不正确的是（ ）。

A、根据样品乙醇含量适当取样 B、加2ml高锰酸钾-磷酸溶液

C、搅匀了立即加入2ml 草酸-硫酸溶液 D、加入5ml显色剂混匀30min后比色

9.高度清香型白酒，国家标准规定其固形物的指标要求是（ ）。

A、≤0.20b/L B、≤0.30g/L C、≤0.50g/L D、≤0.40g/L

工业微生物菌种的分离与筛选

来源：青岛海博

一、微生物工业对菌种的要求

(一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。

（二）、微生物工业对菌种的要求是：

（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;

（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;

（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;

（4）能够高效地将原理转化为产品;

（5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小;

（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;

（7）在发酵过程中产生的泡沫要少;

（8）具有抗噬菌体的能力；

（9）遗传稳定性，

二、工业用微生物菌种的来源及选育

（一）微生物菌种的来源

一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：

（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；

（2）从大自然中采集样品分离；

（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。

当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。

（二）微生物工业菌种的分离

1、野生菌株的分离、筛选过程

（1）新菌种分离与筛选的步骤

菌种分离的流程如下：

标本采集 →标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→ 菌种复筛→性能鉴定→ 菌种保藏

①采样

采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。

采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。

②标本预处理

④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。