高效液相色谱荧光检测法测定药物中的氯乙酰氯
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化学分析计量CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGE第30卷，第1期2021年1月Vol. 30，No. 1Jan. 202159
doi：10.3969／j.issn.1008–6145.2021.01.012
高效液相色谱荧光检测法测定药物中的氯乙酰氯
汤加园，陈向明(滨州医学院药学院，山东烟台 264003)
摘要 建立测定药物中氯乙酰氯含量的高效液相色谱–荧光检测方法。以吖啶酮乙酰肼为荧光标记试剂，对氯乙酰氯进行柱前衍生。在室温下反应15 min，衍生产率达到最大。衍生溶液在XDB–C18柱上，以水和乙腈为流动相进行分析，激发波长和发射波长分别为255 nm和429 nm。氯乙酰氯浓度在1～1 000 nmol／L范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，线性相关系数r=0.999 9。方法的检出限为0.35 nmol／L，仪器精密度和方法精密度分别为0.52%和0.67%(n=6)。样品加标回收率为92.5%～95.6%。该方法简单、准确，精密度良好，可用于测定药物中氯乙酰氯的残留量。关键词 高效液相色谱；荧光检测；氯乙酰氯中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：1008–6145(2021)01–0059–04
Determination of chloroacetyl chloride in drug substance by high performance
liquid chromatography with fluorescence detection
Tang Jiayuan， Chen Xiangming(School of Pharmacy， Binzhou Medical University， Yantai 264003， China)Abstract A high performance liquid chromatography method coupled with fluorescence detection to determine chloroacetyl chloride in drug substance was developed. Acridone acetyl hydrazine was used as fluorescence labeling reagent and chloroacetyl chloride was derived before column. Optimum derivatization was obtained at room temperature for 15 min. The derivative was separated on a reversed-phase XDB–C18 column in conjunction with water and acetonitrile as mobile phase. The excitation and emission wavelengths were 255 nm and 429 nm respectively. The concerntration of chloroacetyl chloride had good linear ralationship with the chromatographic peak area in the range of 1–1 000 nmol／L, the linear correlation coefficient r=0.999 9. The instrument precision and method precision were 0.52%, 0.67%(n=6)，respectively. The detection limit of the method was 0.35 nmol／L，and the recoveries were in the range of 92.5%–95.6%. The method is simple，accurate and showed good repeatability，which can be used to determine the content of chloroacetyl chloride in drug substance.Keywords high performance liquid chromatography; fluorescence detection; chloroacetyl chloride
药物中的遗传毒性杂质是一类能损伤细胞遗
传物质并引起基因突变或体内诱变的物质，较少的
摄入量就能够对身体健康产生严重的损害［1–2］。近
年来，在市场销售的某些药物中发现了遗传毒性杂
质残留，对患者的健康造成威胁，并使相关医药企业
遭受巨大经济损失，因此需要对其在药物中的残留
量进行严格控制［3–4］。欧洲EMA、美国FDA和ICH
相继发布了遗传毒性杂质限量的指南，建议用毒理学关注阈值（Threshold of toxicological concern，TTC）作为遗传毒性杂质的可接受限度，即日摄入
量不超过1.5 µg是可接受的（其致癌风险小于十万
分之一）［5］。中国药典2020年版中，新增了《遗传
毒性杂质控制指导原则》［6］，确定了遗传毒性杂质危
害评估方法、可接受摄入量计算方法和限度制定方
法，为药物中遗传毒性杂质的控制提供了技术指导。脂肪酰氯类化合物是许多药物合成的重要原
通讯作者 陈向明，副教授，研究方向为药物分析，***************收稿日期 2020–10–25引用格式 汤加园，陈向明.高效液相色谱荧光检测法测定药物中的氯乙酰氯［J］.化学分析计量，2021，30(1):59.Tang Jiayuan，Chen Xiangming. Determination of chloroacetyl chloride in drug substance by high performance liquid chromatography with fluorescence detection［J］. Chemical Analysis and Meterage，2021，30(1): 59. 化学分析计量 2021年，第30卷，第1期60
料，其分子中的酰氯官能团是遗传毒性杂质的警示
结构，具有潜在的遗传毒性，需要严格控制其在药物
中的残留量［7］。脂肪酰氯的测定方法包括气相色谱
法［8–9］和高效液相色谱法［10–11］。由于脂肪酰氯的高
反应活性，无论采用哪种色谱方法，都需要在进样前
进行衍生化处理。常用的衍生试剂包括水［12–13］、甲
醇［13］、哌啶［14］等。但是这些方法存在灵敏度低、准
确度差等缺点，从而限制了方法的应用。高效液相
色谱–荧光检测法也是测定样品中痕量成分的常用
分析技术［15］，其灵敏度和选择性显著优于高效液相
色谱–紫外检测法［16］。
笔者以吖啶酮乙酰肼(AHAD)为柱前荧光衍
生试剂，建立了测定药物中氯乙酰氯含量的方法。
通过衍生化降低了氯乙酰氯的活性，提高了检测灵
敏度。所建立的方法成功应用于氟伐他汀钠原料药
中氯乙酰氯的含量测定。1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
高效液相色谱仪：Agilent1260型，配G1311B
型四元梯度泵，G1329B型自动进样器，G1316A型
恒柱温箱，G1321B型荧光检测器，美国安捷伦科技
有限公司。
氯乙酰氯对照品：纯度为98%，上海阿拉丁生
化科技股份有限公司。
氟伐他汀钠原料药：纯度为98%，嘉兴思诚化
工有限公司。
吖啶酮乙酰肼：本实验室自制。
乙腈：色谱纯，天津市福晨化学试剂厂。
实验用水为娃哈哈纯净水。
实验用其余试剂均为分析纯。1.2 溶液的配制
氯乙酰氯标准溶液：精确量取205 μL 氯乙酰
氯对照品，置于25 mL容量瓶中，用无水乙腈溶解
并稀释到标线，摇匀，作为氯乙酰氯的标准储备液，
浓度为0.1 mol／L。低浓度氯乙酰氯工作溶液用无
水乙腈稀释而得。
衍生试剂溶液：精密称取1.34 mg吖啶酮乙
酰肼，用无水乙腈溶解后，定容至100 mL，浓度为5×10–5 mol／L。
所有溶液均密封保存于4℃冰箱中。1.3 衍生过程
分别将100 μL氯乙酰氯标准溶液或样品溶液
和120 μL吖啶酮乙酰肼溶液，依次加入到1.5 mL离心管中，在室温下衍生15 min。衍生反应概况如
图1。反应结束后，向离心管中加入780 μL 50%
乙腈溶液稀释后进样。N
ON
OOCH2CÿNHNH2OOCH2CÿNHNHÿCCH2ClO+ClCH2CÿCl
图1 衍生反应概况1.4 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB–C18 (250
mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流动相：A为水，
B为乙腈；梯度洗脱程序：0～20 min时，B由20%升
至40%，流量为1.0 mL／min；荧光激发波长和发射
波长分别为255 nm和429 nm；进样体积：10 μL。2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
为实现良好的色谱分离和较短的分析时间，
对色谱条件进行了优化。本研究比较了Agilent ZORBAX SB–C18(150 mm×4.6 mm，5 µm)和
Agilent ZORBAX Eclipse XDB–C18(250 mm×4.6
mm，5 µm)色谱柱，结果表明，衍生产物在XDB–C18色谱柱峰形更好，与衍生试剂和副产物的峰均能
基线分离，以乙腈和水为流动相，采用梯度洗脱，
分析时间能控制在15 min内。因此选择Agilent ZORBAX Eclipse XDB–C18色谱柱对衍生产物进行
分离。2.2 衍生条件的优化
氯乙酰氯本身无荧光，且酰氯基团具有高反应
活性。通过衍生化引入荧光基团以提高检测灵敏度，
同时能抑制氯乙酰氯的高活性。酰氯类化合物能与
氨基快速的发生反应，因此本研究选择实验室自制
的吖啶酮乙酰肼为柱前衍生试剂。
氯乙酰氯与吖啶酮乙酰肼的衍生反应无需催
化剂即能发生。为达到最高的衍生效率，实验研究
了温度、时间和衍生试剂的用量对衍生反应的影响，
结果见图2～图4。由图2可知，衍生反应在室温下
能快速发生，提高反应温度，衍生产物的色谱峰面积
略有下降，可能是因为较高的温度导致副反应的发
生，因此实验选择室温下进行衍生化。由图3可知，
在15 min时色谱峰面积达到最大，延长反应时间，
色谱峰面积没有明显变化，因此选择15 min的衍
生时间。为保证衍生反应进行的完全，衍生试剂需
