磷酸果糖激酶 综述

莱茵衣藻磷酸果糖激酶RNAi载体构建及其对莱茵衣藻油脂积累的影响李兴涵;费小雯;邓晓东【摘要】为研究磷酸果糖激酶(PFK2)对微藻油脂积累的影响,克隆了莱茵衣藻磷酸果糖激酶同源基因CrPFK2,构建CrPFK2 RNAi干涉载体并转化莱茵衣藻.通过测定转基因藻在HSM培养下的生物量和油脂含量的结果发现,CrPFK2 RNAi转基因藻株在HSM培养基中生长加快,油脂含量下降了17.03％～21.48％,说明CrPFK2基因表达的降低与藻细胞油脂含量减少成正相关.CrPFK2通过改变光合碳流的多少间接调控藻细胞油脂的合成.该结果为CrPFK2基因应用于微藻油脂的遗传改良将起到重要作用.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2014(041)010【总页数】5页(P155-159)【关键词】莱茵衣藻;磷酸果糖激酶;RNAi;油脂含量【作者】李兴涵;费小雯;邓晓东【作者单位】海南大学农学院,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口571101;海南医学院理学院,海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口571101【正文语种】中文【中图分类】Q945随着化石能源的日益减少、环境污染的日益严重，寻找可再生、清洁无污染的绿色替代能源成为了各国学者的关注[1]。

生物柴油是一种优质清洁燃料，可从各种生物质提炼，因此可以说是取之不尽、用之不竭的能源，在资源日益枯竭的今天，有望取代石油成为替代燃料。

微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富，光合利用率高的自养生物。

微藻在生产生物柴油方面具有光合效率高、生产周期短、环境适应能力强和生物产量高等优点，是制备生物柴油的良好材料[2-3]。

莱茵衣藻诱导中性脂合成的逆境形式主要包括缺氮、缺硫、缺磷、缺铁、温度升高及pH值升高等，其中缺氮诱导中性脂积累最为显著[4]。

我们通过研究缺氮条件下莱茵衣藻进行数字基因表达谱（DigitalGene Expression Profiling，DGE）分析[5]，发现磷酸果糖激酶的表达量相对正常培养变化非常明显。

糖酵解途径的主要调节机制
糖酵解途径是生物体内产生能量的重要途径之一，它包括一系列的反应步骤，将葡萄糖分解为能够转化为ATP的分子。

糖酵解途径的主要调节机制包括以下几个方面：
1. 磷酸化调节：磷酸化是一种常见的调节机制，可以通过激活
或抑制糖酵解途径的关键酶来控制途径的速率。

例如，在肌肉中，活跃的运动会导致肌肉细胞内的AMP/ATP比例升高，从而激活磷酸化酶（AMPK），它会抑制糖酵解途径的关键酶磷酸果糖激酶（PFK），从而
降低糖酵解速率。

2. 激素调节：激素也是糖酵解途径的重要调节因子。

例如，胰
岛素可以促进葡萄糖的运输和吸收，并激活糖酵解途径的多个关键酶，从而提高葡萄糖的利用效率；而胰高血糖素则会抑制糖酵解途径的关键酶，从而降低葡萄糖的利用效率。

3. 底物和产物调节：糖酵解途径中的多个反应步骤都受到底物
和产物的调节。

例如，磷酸果糖激酶的活性受到底物磷酸果糖和产物ATP的浓度影响，当磷酸果糖浓度高、ATP浓度低时，糖酵解途径的
速率会升高；而当磷酸果糖浓度低、ATP浓度高时，糖酵解途径的速率会降低。

4. 基因调节：糖酵解途径中的多个关键酶都是由特定基因编码的，因此基因调节也是糖酵解途径的重要调节机制。

例如，转录因子HIF-1可以激活多个糖酵解途径关键酶的基因表达，从而提高糖酵解速率，以适应低氧环境。

总之，糖酵解途径的主要调节机制包括磷酸化调节、激素调节、底物和产物调节以及基因调节等多个方面，它们共同作用，协调控制糖酵解途径的速率和效率。

第⼗⼀章糖类代谢--王镜岩《⽣物化学》第三版笔记（完美打印版）第⼗⼀章糖类代谢第⼀节概述⼀、特点糖代谢可分为分解与合成两⽅⾯，前者包括酵解与三羧酸循环，后者包括糖的异⽣、糖原与结构多糖的合成等，中间代谢还有磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等。

糖代谢受神经、激素和酶的调节。

同⼀⽣物体内的不同组织，其代谢情况有很⼤差异。

脑组织始终以同⼀速度分解糖，⼼肌和⾻骼肌在正常情况下降解速度较低，但当⼼肌缺氧和⾻骼肌痉挛时可达到很⾼的速度。

葡萄糖的合成主要在肝脏进⾏。

不同组织的糖代谢情况反映了它们的不同功能。

⼆、糖的消化和吸收（⼀）消化淀粉是动物的主要糖类来源，直链淀粉由300-400个葡萄糖构成，⽀链淀粉由上千个葡萄糖构成，每24-30个残基中有⼀个分⽀。

糖类只有消化成单糖以后才能被吸收。

主要的酶有以下⼏种：1.α-淀粉酶哺乳动物的消化道中较多，是内切酶，随机⽔解链内α1，4糖苷键，产⽣α-构型的还原末端。

产物主要是糊精及少量麦芽糖、葡萄糖。

最适底物是含5个葡萄糖的寡糖。

2.β-淀粉酶在⾖、麦种⼦中含量较多。

是外切酶，作⽤于⾮还原端，⽔解α-1，4糖苷键，放出β-麦芽糖。

⽔解到分⽀点则停⽌，⽀链淀粉只能⽔解50%。

3.葡萄糖淀粉酶存在于微⽣物及哺乳动物消化道内，作⽤于⾮还原端，⽔解α-1，4糖苷键，放出β-葡萄糖。

可⽔解α-1，6键，但速度慢。

链长⼤于5时速度快。

4.其他α-葡萄糖苷酶⽔解蔗糖，β-半乳糖苷酶⽔解乳糖。

⼆、吸收D-葡萄糖、半乳糖和果糖可被⼩肠粘膜上⽪细胞吸收，不能消化的⼆糖、寡糖及多糖不能吸收，由肠细菌分解，以CO2、甲烷、酸及H2形式放出或参加代谢。

三、转运1.主动转运⼩肠上⽪细胞有协助扩散系统，通过⼀种载体将葡萄糖（或半乳糖）与钠离⼦转运进⼊细胞。

此过程由离⼦梯度提供能量，离⼦梯度则由Na-K-ATP酶维持。

细菌中有些糖与氢离⼦协同转运，如乳糖。

另⼀种是基团运送，如⼤肠杆菌先将葡萄糖磷酸化再转运，由磷酸烯醇式丙酮酸供能。

磷酸果糖激酶1调节机制磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase-1，PFK-1）是糖酵解过程中的一个关键酶。

它调节糖代谢通路中果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F6P）的合成。

磷酸果糖激酶1是一个大分子复合体，由四个同源二聚体组成。

每个单体由多个结构域组成，包括N末端底物结合结构域和C末端调节结构域。

磷酸果糖激酶1的调节机制涉及多个调节因子的作用，包括底物浓度、ATP/ADP比例、pH值和磷酸化状态等。

首先，底物浓度是磷酸果糖激酶1调节的重要因素。

当细胞内F6P浓度较高时，F6P与磷酸果糖激酶1的底物结合结构域结合，使其呈现活性构象，从而促进磷酸果糖激酶1的催化活性。

相反，当F6P浓度较低时，底物结合结构域与磷酸果糖激酶1分离，导致其失去活性。

这种底物浓度依赖性的调节机制可以确保磷酸果糖激酶1的活性与F6P浓度保持一致，有助于维持糖酵解通路的稳定状态。

其次，ATP/ADP比例对磷酸果糖激酶1的调节也非常重要。

高ATP/ADP 比例会抑制磷酸果糖激酶1的活性，从而降低糖酵解通路中F6P的合成。

这是因为高ATP/ADP比例表示细胞内能量供应充足，不需要进一步合成ATP，因此磷酸果糖激酶1被抑制。

相反，低ATP/ADP比例会促进磷酸果糖激酶1的活性，增加F6P的合成，以满足能量需求。

此外，细胞内pH值也可以影响磷酸果糖激酶1的活性。

在细胞发生酸中毒时，pH值下降，会使磷酸果糖激酶1活性增加，从而增加F6P的合成，以增加ATP生成。

相反，在细胞发生碱中毒时，pH值升高，会使磷酸果糖激酶1活性减少，降低F6P的合成，减少ATP生成。

这种pH依赖性的调节机制有助于维持细胞内环境的稳定性，确保糖代谢通路的正常运作。

最后，磷酸化状态也是磷酸果糖激酶1调节的关键。

磷酸化状态的调控涉及多个激酶和磷酸酸化酶的活性调节。

在高能量状态下，激酶磷酸果糖激酶1磷酸化，提高其催化活性。

相反，在低能量状态下，磷酸酸化酶会去磷酸化磷酸果糖激酶1，降低其活性。

磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0535规格：100T/96S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体100 mL×1瓶4℃保存试剂一液体20 mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1瓶-20℃保存试剂三液体25μL×1瓶-20℃保存试剂四液体10μL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用前加入17 mL试剂一和1.13 mL蒸馏水充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴5分钟，用不完的试剂-20℃分装保存一周；2、试剂三：液体置于试剂瓶内EP管中。

临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为1:50的体积比例充分混匀，现用现配；用不完的试剂三原液建议-20℃分装保存，避免反复冻融；3、试剂四：液体置于试剂瓶内EP管中。

临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为1:125的体积比例充分混匀，现用现配。

产品说明：PFK（EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板（UV）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）提取液体积（mL）为500-1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或者200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

货号：BC0535规格：100T/96S产品内容：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。

试剂三：液体×1支，-20℃保存。

试剂四：液体×1支，4℃保存。

产品说明：PFK（EC2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。

需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板（UV）、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本的前处理1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）提取液体积（mL）为500-1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或者200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1:5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

二、测定步骤：1.紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.样本测定（1）在试剂二瓶中加入17mL试剂一和1.13mL蒸馏水充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴5分钟。

与葡萄糖代谢相关的酶
与葡萄糖代谢相关的酶有以下几种：
1. 糖激酶（hexokinase/glucokinase）：将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸。

2. 磷酸果糖（fructokinase）：将果糖转化为果糖-6-磷酸。

3. 磷酸己糖激酶（phosphoglucose isomerase）：将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸。

4. 磷酸果糖激酸（phosphofructokinase）：将果糖-6-磷酸转化为果糖-1,6-二磷酸。

5. 三磷酸甘油酸化酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）：将磷酸甘油醛转化为磷酸甘油酸。

6. 磷酸烯醇化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase）：将磷酸磷酸烯醇转化为磷酸磷酸烯醇。

7. 磷酸果酸异构酶（enzymes of the citric acid cycle）：参与柠檬酸循环，将柠檬酸转化为脱氢酸、脱羧酸等。

这些酶在葡萄糖的吸收、转化、代谢过程中发挥关键作用。

鱼磷酸果糖激酶(PFK)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定鱼肝脏及相关液体样本中磷酸果糖激酶(PFK)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鱼磷酸果糖激酶(PFK)水平。

用纯化的鱼磷酸果糖激酶(PFK)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸果糖激酶(PFK)，再与HRP标记的磷酸果糖激酶(PFK)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的磷酸果糖激酶(PFK)呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鱼磷酸果糖激酶(PFK)浓度。

试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

用液氮迅速冷冻保存备用。

标本融化后仍然保持2-8℃的温度。

果糖-1-磷酸转移酶参与的反应概述及解释说明1. 引言1.1 概述果糖-1-磷酸转移酶是一种重要的酶类，参与多种生化反应过程。

它能催化果糖和磷酸基团之间的转移反应，通过该反应将果糖磷酸化，生成果糖-1-磷酸。

果糖-1-磷酸是关键的中间产物，在细胞代谢和能量产生过程中起着重要作用。

因此，深入了解果糖-1-磷酸转移酶参与的反应机制对于揭示细胞代谢调控和相关传递信号等方面具有重要意义。

1.2 文章结构本文将首先介绍果糖-1-磷酸转移酶的基本概念，并对其进行详细描述。

接着，我们将概述该反应的背景知识，包括介绍果糖-1-磷酸转移酶的催化机制以及相关反应概述。

在这之后，我们将分析该反应的关键步骤，并探讨调控该反应和影响因素。

最后，我们将总结目前已有的主要发现，并提出存在的问题和展望未来的研究方向。

1.3 目的本文的目的是全面探讨果糖-1-磷酸转移酶参与的反应机制，从背景知识到关键步骤分析，进而阐述调控该反应和影响因素。

通过深入了解果糖-1-磷酸转移酶的功能和作用机制，我们可以为细胞代谢、能量产生以及相关传递信号等领域的研究提供重要参考，并为未来开展更深入的研究提供方向指导。

2. 背景知识：2.1 果糖-1-磷酸转移酶介绍果糖-1-磷酸转移酶是一种重要的催化酶，参与了细胞内果糖代谢途径中的关键步骤。

该反应是将果糖-1-磷酸（F1P）转化为果糖-6-磷酸（F6P），在这个过程中，一个无机磷酸基团被转移到另一个分子上。

该酶由一条多肽链组成，在许多生物系统中广泛存在，包括人体、动物和植物。

在细胞内，果糖-1-磷酸转移酶主要位于胞浆或线粒体中。

2.2 反应概述果糖-1-磷酸转移反应是果糖代谢途径中的关键步骤之一。

在此反应中，果糖-1-磷酸（F1P）经过催化作用被转化为果糖-6-磷酸（F6P）。

具体而言，果糖-1-磷酸转移酶将底物F1P的一个无机磷酸基团转移到ADP分子上，生成F6P和ATP。

这个反应是一个磷酸化反应，同时也是一个可逆反应。

6-磷酸果糖检测
果糖-6-磷酸（Fructose-6-phosphate），又称6-磷酸果糖，是生物体内的常见分子之一，也是糖解作用的过程中所生成的产物之一，属于酮糖。

在糖解作用中，果糖-6-磷酸是葡萄糖-6-磷酸在磷酸葡萄糖异构酶（Phosphoglucose isomerase）的催化之下所形成；之后又会经由磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase）的催化，以及消耗一个ATP，生成果糖-1,6-双磷酸，是糖解作用中的第二次磷酸化作用。

迪信泰检测平台使用高效液相色谱的方法，使用Agilent 1260 Infinity型高效液相色谱仪对样品进行分离，DAD检测器鉴定，该方法可以高效、精准的检测6-磷酸果糖的含量变化。

此外，我们还提供其他三羧酸循环系列检测服务，以满足您的不同需求。

样品制备
三羧酸循环代谢物提取方法（此部分涉及到公司的核心工艺，以下提供常规的提取工艺）
1）取10 mL左右的样品；
2）5℃，12000rpm离心10 min；
3）取上清；
4）0.45 μm的微孔滤膜过滤，用HPLC检测。

HPLC测定6-磷酸果糖样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。

周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关质谱参数（中英文）
3.质谱图片
4. 原始数据
5. 6-磷酸果糖含量信息。

磷酸果糖激酶（PFK ）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0530规格：50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60 mL×1瓶4℃保存试剂一液体40 mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1瓶-20℃保存试剂三液体45μL ×1瓶-20℃保存试剂四液体20μL ×1瓶4℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用前加入2.8 mL 双蒸水充分溶解备用；-20℃分装保存一周；2、试剂三：液体置于试剂瓶内EP 管中。

临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为2:13的体积比例充分混匀，现用现配；用不完的试剂三原液建议-20℃分装保存，避免反复冻融；3、试剂四：液体置于试剂瓶内EP 管中。

临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为4:65的体积比例充分混匀，现用现配；4、PFK 工作液（可测25个样）的配制：取19 mL 试剂一和1.26 mL 试剂二充分混匀，现用现配。

产品说明：PFK （EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP 转化为果糖-1,6二磷酸和ADP ，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

PFK 催化果糖-6-磷酸和ATP 生成果糖-1,6-二磷酸和ADP ，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH 氧化生成NAD +，在340nm 下测定NADH 下降速率，即可反映PFK 活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细菌、细胞或组织样本的制备细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s ，间隔10s ，重复30次）；8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。