细胞传代培养标准操作规程

实验5 细胞传代培养【实验原理】细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

【实验目的】熟练掌握细胞的传代培养方法。

【器仪、材料及试剂】1．仪器：倒置显微镜，培养箱、超净工作台等。

2．材料：贴壁细胞株、培养瓶、吸管、废液缸等。

3．试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）。

【操作步骤】1．将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

2．加入0.5—1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。

3．瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。

随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰蛋白酶弃去，加入10ml培养液终止消化（观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。

一般室温消化时间约为1—3分钟）。

4．用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，置37℃下继续培养。

第二天观察贴壁生长情况。

附：消化液配制方法：称取0.25克胰蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。

胰蛋白酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02％。

【注意事项】1．传代培养时要注意严格的无菌操作，并防止细胞之间的交叉污染。

2．酶解消化过程中要不断观察，消化过度会对细胞造成损害，消化不够则难于将细胞解离下来。

3．传代后每天观察细胞生长情况，了解细胞是否健康生长：健康细胞的形态饱满，折光性好。

4．掌握好代传代时机：健康生长的细胞生长致密，即将铺满瓶底时，即可传代【实验报告】试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤。

【思考题】1．细胞传代培养的目的是什么？2．判断细胞健康的标准是什么？3．如何估计是否传代和传代的方式？。

细胞传代操作步骤及注意事项细胞传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。

当细胞随着培养时间的延长和细胞不断分裂，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止，且也会因营养物不足和代谢物积累而不利于细胞生长或发生中毒。

因此，细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释，分种成多瓶，细胞才能继续生长。

这一过程就叫传代。

细胞传代作为一种常规的实验操作，不但可以扩大细胞培养的数量，同时也可以避免细胞因进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。

所以为了让细胞保持在对数生长期，维持细胞旺盛的分裂能力，这时候就需要进行细胞传代。

细胞传代要在严格的无菌条件下进行，并且根据不同细胞采取不同的方法：☑贴壁生长的细胞用消化法传代；☑部分贴壁生长但贴壁不牢固的细胞可以采用直接吹打传代；☑悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心沉淀后再分离传代，或直接用自然沉淀法吸除上清后，再吹打传代。

上次讲了细胞复苏操作，今天来讲讲细胞传代的操作（适用于贴壁细胞的传代培养）！细胞复苏流程图细胞传代流程图01细胞传代前准备➡实验开始前，将15mL离心管、移液管、枪头等实验需要用到的耗材放入无菌超净工作台，紫外线照射30min。

➡将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。

➡倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度，当细胞生长密度达到80%~90%汇合度即可进行传代。

02胰蛋白酶/EDTA消化➡弃去旧培养基，PBS洗去残留的旧培养基，重复洗两次。

注意：贴壁加入到培养皿的边缘，不能直接对着细胞加入PBS，容易把细胞都吹起来。

这一步的目的是为了去掉残余的培养基，残余的培养基会含有血清和一些离子等，不利于接下来的消化。

➡弃去PBS，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA（T25培养瓶加入约1.5mL，T75培养瓶加入约3mL），迅速铺匀，保证充分接触细胞表面（消化时间视具体细胞而定）。

➡显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。

细胞传代标准操作流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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细胞传代培养标准操作规程一、实验名称：细胞传代培养二、实验目的：传代培养细胞株三、背景知识：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。

此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。

这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。

对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。

在一代中，细胞倍增3～6次。

细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。

常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。

一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。

细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

四、实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

五、实验材料和药品：（一）实验药品：DMEM培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS缓冲液。

（二）实验仪器和材料：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台；培养瓶，弯头吸管，废液缸，离心管；75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞六、实验步骤：1．入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。

2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

将实验所需培养基置37℃下预热。

3．手在进入超净台前应消毒；超净台台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。

4．打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。

细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。

第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。

第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。

第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。

确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。

第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。

培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。

细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。

细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。

细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。

第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。

定期检查细胞的形态和生长状态。

第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。

确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。

第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。

冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。

细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。

细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。

降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。

第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。

定期检查液氮罐的液位和温度。

第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。

检查培养箱、显微镜等设备是否正常。

第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。

快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。

细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。

离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。

细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。

细胞培养传代及冻存操作规程细胞培养、传代及冻存操作规程⼀、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊⼦、温⽔（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%⾎清、双抗、1.5ml 离⼼管。

2、操作步骤①取相应体积的培养基放⼊到培养板中并加⼊双抗，放⼊CO2培养箱中预热，然后取适量的冷⽔加⼊到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开⽔边⽤温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升⾄39℃为⽌（为防⽌在移动过程中温度降低可把温度调⾼1——2℃。

②⽤镊⼦将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放⼊提前准备好的温⽔中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后⽤移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液⼀起吸出放到1.5ml离⼼管中，5000rpm/min 离⼼2min，尽量的除掉上清，然后在加⼊500µl培养基反复吹打待混合均匀后放⼊到事先准备好的培养板中并注明名称、⽇期及操作⼈。

⼆、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加⼊相应体积的培养基之后放⼊培养箱中预热，添加培养基的⽅法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，⽤DPBS清洗两遍，在加⼊相应体积的0.25％胰蛋⽩酶，使板底细胞都浸⼊溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。

添加胰蛋⽩酶的体积如下表所⽰③消化时间完成后应⽴即终⽌消化，⼀是直接加⼊培养基，⼆是吸除胰蛋⽩酶之后在加培养基，加⼊培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停⽌吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放⼊培养箱24⼩时后换液。

2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的⽣长状态，以便于下⼀步实验的顺利进⾏。

其中有两点很重要，第⼀消化的时间，消化的时间并不是⼀成不变的，要根据细胞的状态随时终⽌消化，上⾯②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第⼆吹打的⼒度跟全⾯性，吹打的⼒度⼀定要适中，不能太⽤⼒避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边⾓的，那⾥会有很多细胞残留，需要提醒的是⼀定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可⽤枪头将其刮下在吹打。

1、目的：建立Vero细胞培养传代标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化。

为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养传代的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养传代操作流程。

2、范围：适用于Vero细胞培养传代实验人员.3、编制依据《企业注册标准WS4—（S—009-2）—2003Z》。

4、Vero细胞培养传代操作规程4。

1试药与试液1、细胞：Vero细胞。

2、液体：0。

25%胰蛋白酶溶液；7。

5%碳酸氢钠溶液;小牛血清；PBS缓冲液；10×199培养液、灭菌注射用水、EDTA溶液。

4.2仪器与用具1、恒温培养箱；2、倒置生物显微镜。

4。

3操作方法4.3.1细胞培养、传代1、准备好细胞培养传代所需物品，紫外线照台30min。

2、挑选细胞形态佳、无污染的Vero细胞，弃旧生长液.3、细胞面经少量EDTA溶液洗涤后,加入胰蛋白酶等消化液适量（胰酶铺平培养瓶底为佳），倒置显微镜下观察培养瓶内细胞,一旦发现大量细胞胞质回缩,细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，4、把细胞培养瓶置37。

0℃±0。

5℃孵育让残存的胰酶继续消化,（在37℃胰酶消化效果最佳）,每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆,透亮，细胞间隙明显增大时，加入先配好的完全培养基适量终止消化,用吸管轻柔吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。

5、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验,观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略.）6、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等,一般按照1：3-1：5比例进行传代。

先用滴管吹打混匀细胞悬液，平均分配细胞悬液到各个培养瓶中，补足完全培养基使液体总体积达到40ml左右，平放到培养箱中继续培养。

7、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。

4。

3.2填写记录：1、随试验进程做好试验记录（按实验记录规范要求)，包括试剂的厂家、批号、效期，试验时间，试验结果。

一、生物安全柜的操作规程1.进入细菌、细胞间进行实验，必须穿上白大褂和乳胶手套，才能开始后续所有实验操作。

2. 生物安全柜内必备用品：酒精灯、打火机、1000μl枪、200μl枪、200μl枪头一盒、1000μl枪头一盒、移液枪、擦台面的泡有棉球的酒精瓶、装有EP管的瓶子、镊子、记号笔、细胞培养瓶（最多一袋）。

3. 开启紫外灯灭菌之前，请用酒精棉球擦拭台面，并且注意检查如下几点：准备一个废液缸，放入生物安全柜中；移液管是否够用，生物安全柜里面保证至少有一筒装有移液管的铁皮桶；酒精灯的酒精量是否够，若不够请及时添加工业酒精；移液枪是否有电，发现移液枪吸液速度慢了请及时充电；1000μl和200μl枪头是否够，保证生物安全柜里面有各有一盒；擦台面的棉球是否还有，若没有了请及时添加棉球（将医用脱脂棉撕成适宜大小的棉球）和75%酒精；各种型号EP管是否还有，没有了请及时灭菌放入生物安全柜内。

4. 灭菌消毒：开启紫外灯灭菌20-30分钟保证柜内空间无菌，如果紧接着其他实验使用生物安全柜，灭菌5-10分钟即可。

5. 灭菌完后，请打开风机，将挡板升高到一定高度，抽气5-10分钟，将臭氧全部排出。

6. 生物安全柜内所有操作必须带乳胶手套。

7. 实验完毕后，请适当处理废弃物，并且再次用酒精棉球擦拭台面。

8. 生物安全柜内只放一些必备用品，以免影响操作。

如果是私人实验所需物品，请在紫外灭菌之前将其放入进行灭菌。

紫外灭菌后，带入生物安全柜内操作的物品必须先经过灭菌处理。

为了方便他人实验，实验完毕后请务必将私人的实验用品取出。

二．细胞培养箱操作规程1. 培养箱每周换两次超纯水，每两月清洁培养箱一次。

清洁时用75%医用酒精擦拭培养箱，擦拭过程中应关闭培养箱。

2. 取放细胞的过程中严禁对着培养箱内说话，避免引入细菌；取放细胞的手套要喷过酒精，放进培养箱的培养瓶盖最好用75%医用酒精擦拭过。

3. 调节CO2钢瓶的压力为0.05–0.08 MPa，调节压力的时候应关闭培养箱，除仪器负责人不应随便调节CO2压力和仪器参数。

细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。

2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。

3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。

可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。

4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。

5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。

6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。

首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。

接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。

7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。

细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。

细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。

而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。

细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。

2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。

3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。

一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。

4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。

然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。

最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。