传代细胞培养实验ppt课件

实验二细胞的传代培养【实验目的】1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。

2. 了解细胞传代培养的意义。

【实验原理】细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。

贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。

因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。

这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。

细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。

传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。

接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。

一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25℃，热带鱼类细胞为30℃，冷水鱼类细胞为20℃，哺乳动物细胞为37℃。

细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。

单纯换液不需要接种细胞。

【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640 或MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30 分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。

在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。

1．观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时可以传代；2．超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台酒精灯左侧；3．开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，培养瓶瓶口、瓶盖均需过酒精灯火焰后再盖好；4．清洗细胞表面：打开移液管盒，用普镊捏住移液管（5mL）后部从盒子中拖出（注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品），安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。

细胞传代实验步骤及原理细胞传代呀，就像是给细胞们搬个新家，让它们继续茁壮成长呢！咱先说说为啥要进行细胞传代吧。

你想啊，细胞们在一个小地方待久了，空间不够了呀，营养也不够分啦，这时候就得给它们挪个地儿，让它们能更好地生长、繁殖。

这就好比一群人住在小房子里，时间长了会觉得拥挤，得换个大房子住住才舒服嘛。

那怎么进行细胞传代呢？首先得准备好各种工具和材料呀，比如培养瓶、培养液、胰酶等等。

这就好像你要搬家得先准备好箱子、车子这些东西一样。

然后呢，把细胞从原来的培养瓶里取出来。

这可不能太粗鲁哦，得小心翼翼的，不然把细胞弄伤了可不好。

就好像你搬易碎品的时候得轻拿轻放一样。

这时候胰酶就派上用场啦，它能帮着把细胞从瓶底上“松一松”，让它们更容易被取出来。

取出来后，把细胞放到新的培养瓶里，再加入新鲜的培养液。

哇，细胞们这下可有了新的环境啦，又能开心地生长啦！这就像给人换了个新房间，还准备了好吃好喝的，多舒服呀。

不过这里面也有很多要注意的地方哦！比如胰酶的作用时间不能太长也不能太短，不然都会影响细胞的状态。

这就像做菜放盐一样，放多了太咸，放少了没味道。

还有啊，操作的时候一定要干净卫生，可不能让细菌什么的混进去，那细胞可就遭殃啦！细胞传代可是个细致活儿，得有耐心，还得细心。

你想想，细胞那么小，我们得像照顾小宝宝一样照顾它们呢。

要是不小心出了差错，那之前的努力可就白费啦！每次进行细胞传代的时候，我都觉得自己像个小园丁，在照顾着我心爱的小花朵们。

看着它们在新的环境里健康生长，心里那叫一个美呀！总之呢，细胞传代是细胞培养中非常重要的一步，只有做好了这一步，我们才能让细胞更好地为我们的研究和实验服务呀！所以呀，大家可千万不能马虎哦！一定要认真对待每一次细胞传代，让我们的细胞宝宝们茁壮成长吧！。

1细胞传代准备工作1.1细胞传代所需培养液及试剂需提前放置于生物安全柜内预热至室温备用。

1.2细胞传代材料，滴管、移液管、培养器皿、计数板、橡皮乳头。

2细胞传代步骤2.1人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。

2.2细胞传代前先在倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数观察。

2.3打开超净工作台的紫外灯照射台面30 min左右，关闭超净工作台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。

2.4超净工作台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。

2.5贴壁细胞的传代2.5.1贴壁细胞用滴管或移液管吸去培养器皿中的旧培养液。

2.5.2酌情可用2～3 mL 0.02%EDTA溶液洗去残留的旧培养基。

2.5.3以25ml培养瓶为例，向瓶内加入1ml消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。

2.5.4在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，应立即终至消化。

2.5.5吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鲜培养液，终至消化。

2.5.6用弯头滴管，吸取瓶内培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液。

2.5.7计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液(7～10ml／大瓶，3～5 mL ／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。

盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

2.6半悬浮细胞及悬浮细胞培养的传代2.6.1半悬浮细胞先用滴管将细胞轻轻吹下来，把细胞悬浮液加入离心管离心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。

2.6.2把细胞沉淀制成悬液，计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。

2.6.3悬浮细胞直接用滴管或移液管吸入离心管离心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。

2.6.4把细胞沉淀制成悬液，计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。