紫外分光光度法

紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的。因此，这种吸收光谱决定于分子中价电子的分布和结合情况。按分子轨道理论，在有机化合物分子中有几种不同性质的价电子：形成单键的电子称为σ键电子；形成双键的电子称为π键电子；而象氧、氮、硫、卤素等含有未成键的孤对电子称为n电子。当分子吸收一定能量之后，其价电子将从能量较低的轨道跃迁到能量较高的反键轨道。分子内各种电子的能量高低的次序为
下面分别讨论n→σ*，π→π*和n→π*的跃迁。
1、n→σ*的跃迁
n→σ*跃迁需要的能量比σ→σ*小，相应的吸收波长在200nm附近。当饱和碳氢化合物中的H被含有n电子的N，O，S和X（F,Cl,Br,I）等杂原子取代时，将发生n→σ*跃迁，因此在较长波长处比相应的饱和碳氢化合物多一个吸收带。在有些有机化合物中，由取代反应而引入的含有未共享电子对的杂原子基团，如-NH2，-NR2，-OH，-OR，-SH，-F,-Cl，- Br,-I等后，使吸收峰的波长向长波方向移动，这种效应称为红移效应。这种能使吸收波长红移，并使吸收强度增加的杂原子基团称为助色团。一般n→σ*跃迁的摩尔吸收系数较小。如水、醇和醚等在紫外可见光谱分析中可以作为溶剂。
仪器药品：
UV-2550可见紫外分光光度计，石英比色皿，滤纸，漏斗，100ml容量瓶，无水乙醇，醋酸地塞米松片。
教学方法：讲授、演示
教学时数：4学时
教学过程：（教师授课思路、设问及讲解要点）
一、实验原理
分子和原子一样，也有它的特征能级。分子内部的运动可以分为价电子运动，分子内原子在平衡位置附近的振动和分子绕其重心的转动。因此子具有电子（价电子）能级、振动能级和转动能级。
七、思考题
1、紫外分光光度法分析的原理是什么？
2、哪些物质能够用紫外分光光度法分析？
3、如何对物质的含量进行分析？
八、教学后记
实验题目：紫外分光光度法
测定醋酸地塞米松的含量
教学目标：
1、了解可见紫外分光光度计的基本结构及操作步骤。
2、学习可见紫外分光光度法的测定物质含量的原理和方法。
3、掌握药物标示量的计算方法。
教学重点：
学习可见紫外分光光度法的测定物质含量的原理和方法。
教学难点：
了解可见紫外分光光度计的基本结构及操作步骤。
2、π→π*和n→π*的跃迁
有机化合物中由π→π*和n→π*产生的吸收带最有用，它们的吸收峰在近紫外区或可见光区。由吸收带波长可以预测未知有机化合物的某些官能团或由有机化合物的结构推算最大吸收波长λmax。
含有π电子的基团，如双键或三键，会发生π→π*跃迁。含有未共享n电子对的N，O，S及卤素等基团会发生n→π*跃迁。发生这两种跃迁的分子中需要有不饱和键，以提供π*。在许多有机化合物中往往同时含有n电子和π电子，可以同时发生π→π*和n→π*跃迁，π→π*跃迁的几率比n→π*大，吸收带强度大。一些具有不饱和键和含有孤对电子对的基团，能对200nm以上的光产生吸收，这种基团称为生色团。通常π电子体系是紫外和可见的生色团，σ电子是远紫外的生色团。
由以上分析可知,几乎所有的有机分子的紫外-可见吸收光谱都是由于π→π*和n→π*跃迁所产生的。因此这两种跃迁在紫外-可见光区对于样品的定性和定量分析应用很广泛。
醋酸地塞米松（又名醋酸氟美松）为甾体激素类药物。临床上主要用于治疗风湿热、类风湿性关节炎、红斑狼疮和白血病以及湿疹、皮炎等疾病。其分子结构（见图2）为环戊烷骈多氢菲的甾体母核结构，由于该药物结构中有3-酮基和两个双键共轭，因此该药物在特定波长处具有特定的紫外吸收，可以根据最大的紫外吸收对其特定的结构进行鉴定，同时在最大波长吸收处可以进行定量分析。定量分析根据朗伯-比尔定律：
6、再在最大吸收波长范围附近确定吸收波长范围，扫描测定其吸光度，保存数据；
7、打印图表，关闭仪器电源。
8、按吸收系数法计算本品的含量，计算公式如下
式（2）中：
A为样品吸光度；
W为平均片重（g/片）；
M为称样重量（g）；
标示量为0.75mg/片；
E为醋酸地塞米松（C24H31FO6）的吸收系数，按354计算。
五、数据处理
1、指出醋标示量%，应为90.00%-110.00%。
六、注意事项
1、实验过程由于片剂的赋形剂不溶于乙醇，供试品溶液需要经过过滤、稀释后再测定。
2、实验完毕，应将比色皿从样品池中取出，并清洗干净。
3、比色皿透光面应用擦镜纸沿着一个方向擦。
四、实验步骤
(一)样品溶液的配制
1、取本品10片，精密称定，研细，再精密称取0.4g（约醋酸地塞米松7.5mg）,置50ml量瓶中，加乙醇35ml，超声溶解20分钟，放冷至室温；
2、加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 ml，置另一50ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，待用。
(二)样品的测定
A = ε bc式（1）
式（1）中：
A为吸光度，ε为吸收系数，b为吸收池厚度，c为样品浓度。
二、紫外分光光度计的组成
紫外分光光度计主要由光源、单色器、样品池、检测器和记录装置及计算机组成。
三、仪器与药品
1、仪器：UV-2550紫外分光光度计，石英比色皿，滤纸，漏斗，100ml容量瓶。
2、药品：无水乙醇，醋酸地塞米松片。
σ*〉π*〉n〉π〉σ
如图所示：
在大多数有机化合物分子中，价电子总是处在n轨道以下的各个轨道中，当受到光照射时，处在较低轨道能级的电子将跃迁至较高能级。由图可见，可能的跃迁有σ→σ*，σ→π*，π→σ*，n→σ*，π→π*，n→π*等六种，其中σ→σ*、σ→π*和π→σ*跃迁需要的能量大，因此产生这三种跃迁所吸的光波长小于200nm,位于远紫外光区，对它们的紫外-可见吸收光谱研究得较少，同时它们在紫外-可见光区无吸收带，所以在紫外-可见吸收光谱分析中常用作溶剂。如戊烷、己烷、环己烷等。
1、依次打开电脑电源，分光光度计电源，在桌面上双击UV-Probe图表，输入密码；
2、等待仪器自检查，所有自检项目完成通过后，点击“确定”，再点击“基线”，进行基线校正；
3、将样品池和参比池均放上空白，点击“自动调零”。
4、将样品池换上样品，选择“编辑”中的“方法”，建立数据采集的方法；
5、然后再在200nm-400nm范围内扫描，确定最大吸收波长，保存数据；