论 著
细胞传代对骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化的影响
霍建忠陈峥嵘
（复旦大学附属中山医院骨科上海２０００３２）
【摘要ｌ目的观察在成软骨诱导培养条件下，细胞传代对骨髓闻充质干细胞（ＭＳＣｓ）体外成软骨能力的影响。方法不同代ＭＳＣｓ成 软骨诱导后，观察细胞生物学特性以及通过免疫荧光、ＲＴ—ＰＣＲ测定特异性软骨细胞外基质ａｇｇｒｅｃａｎ的表达情况。结果经成软骨诱 导后，第２、４代ＭＳＣｓ表达ａｇｇｒｅｃａｎ明显较第６、８代细胞高。结论ＭＳＣｓ很可能由多种形态功能接近，分化潜能有略有差异的细胞 组成；在成软骨诱导培养条件下，对此传代后成软骨能力减弱。 【关键词ｌ骨髓问充质干细胞 ＩＩ型胶原蛋白 成软骨诱导 【中图分类号ｌ Ｒ３ ２ ９．２ Ｉ ｌ文献标识码ｌ Ａ 【文章编号ｌ ｌ６７４－－０７４２（２００８）０１（Ｃ）－０００６－－０２
组织工程方法修复关节软骨缺损及退行性变是目前的研究热点和
重点，而其他方法疗效均不显著仁Ｉｔｌ。随着细胞生物学的发展，尤
其是干细胞研究的飞速进展，使具有多向分化潜能的骨髓间充质干 细胞（ｍｅｓｅｎｅｈｙｍａｌ：ｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）成为组织工程方法修复关节软 骨缺损的重要种子细胞来源Ｉ 。ＭＳＣｓ具有自我更新．多向分化潜
能，可以分化成骨 Ｉ、软骨１４－６Ｉ、脂肪…和肌肉【 Ｉ等细胞；并且易于获
取，能够在体外大量无限增殖 Ｉ。研究… 显示，ＭＳＣｓ可以在一
定的条件下分化成软骨细胞，表达特异性软骨细胞外基质一胶原蛋白 Ⅱ（ＣｏｌｌａｇｅｎⅡ）、ａｇｇｒｅｃａｎ等；而将ＭＳＣｓ负载于纤维连接蛋白涂布的
羟基磷灰石小管中，植入裸鼠皮下后，能够生长出软骨组织ｌ１２１；然
而，组织工程用ＭＳＣｓ需先在体外成软骨细胞诱导、大量扩增后，负
载于一定载体植人体内修复软骨缺损。在成软骨诱导培养条件下，不
同代ＭＳＣｓ的自我更新、向软骨细胞分化能力是否会有改变，尚未见 报道。我ｆｆ】将ＭＳＣｓ在成软骨诱导条件下培养，观察不同代细胞的生
口腔生物医学２０１５年９月（第６卷第３期） Ｏｒａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．３，Ｓｅｐ．２０１５
［文章编号］ １６７４－８６０３（２０１５）０３－０１４３・０７
体外传代对人脐带问充质干细胞生物学特性的影响
苏晓霞 ，廖立 ，金岩 ，周 洪
（１．西安交通大学医学院附属口腔医院正畸科，陕西西安７１０００４；２．第四军医大学口腔医院
组织工程研究中心，军事口腔医学国家重点实验室，陕西西安７１００３２） ・１４３・
［摘要］ 目的：观察人脐带间充质干细胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＵＣＭＳＣｓ）体外长期传代扩增
后形态表型、增殖及分化特性的变化。方法：分别以双酶消化及组织块法分离培养ｈＵＣＭＳＣｓ；细胞传至１８代（Ｐ１８），观察细胞
形态、生长曲线、克隆形成、细胞周期、干细胞表型、多向分化能力的变化，全面评测连续传代对ｈＵＣＭＳＣｓ生物学特性的影响。
结果：双酶消化结合组织块法可高效分离获得大量ｈＵＣＭＳＣｓ，细胞稳定传代并保持间充质干细胞特性；早期细胞多呈长梭形
或纺锤形，至Ｐ１８时呈多角不定型且细胞体积变大，胞浆增加明显。传代至Ｐ１８后，ｈＵＣＭＳＣｓ的群体倍增时间增加至６０ ｈ以
上，绝大多数细胞处于Ｇ。／Ｇ 期，且成纤维细胞集落形成单位（ｃｏｌｏｎｙ—ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ—ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＣＦＵ—Ｆ）形成降低，克隆集落减小。
ｈＵＣＭＳＣｓ可表达且不因持续传代丢失间充质干细胞标记，但仅早期传代细胞表达多能干细胞标记Ｏｃｔ－４及ＳＳＥＡ－４。特异性
染色及相关基因表达检测提示Ｐ１８ ｈＵＣＭＳＣｓ的成脂肪、成软骨及成骨诱导分化能力较早期传代细胞减弱。结论：ｈＵＣＭＳＣｓ是
具备高增殖活性和多向分化特性的间充质干细胞群，体外长期传代扩增的ｈＵＣＭＳＣｓ呈现一定的复制性衰老趋势，但不会丢失
间充质干细胞的起源与发展
间充质干细胞(MSC)，是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，经诱导可分化为多种间质组织，如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等。
20世纪70年代，Friedenstein等从骨髓中分离出一种纤维原细胞，并证明其可在 体外大量扩增，并具有定向分化的特征。
1991年，Caplan教授首次提出MSCs的概念，他也被业界称为“间充质干细胞之父”。此后，MSCs进入高速发展阶段。
1995年，Lazarus等第一次将MSCs运用于临床。
2000年，Erics等首次报道了从脐带血中分离培养出MSC，并认为其不仅能提高造血干细胞的骨髓归巢和早期造血恢复，还具有免疫原性弱的特性。
经过这几十年漫长的发展，大量的体外和动物体内实验表明，间充质干细胞对许多疾病具有潜在治疗作用。
第二部分：生物制剂及间充质干细胞
生物制剂的介绍
赵金霞：大家上午好！我是风湿科的赵大夫，我今天主要跟大家介绍一下生物制剂以及间充质干细胞在风湿病中的应用。
什么是生物制剂？
咱们先来看第一个问题，什么是生物制剂，我们应用生物制剂，首先要了解到底什么是生物制剂呢？广义的生物制剂实际上就是利用现在的生物技术，借助某些微生物，(植物或者动物，包括细菌等等)生产的药品；或者是采用DNA重组技术或者其他的生物新技术研制的,它是蛋白类或者是核酸类的药物。咱们风湿科所说的生物制剂主要是用于治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎这两种病的，不同于传统的抗风湿药的一些新的抗风湿病的生物制剂。
生物制剂跟传统的药物有哪些不同的特点呢？
首先它分子量是不同的，不同于小分析的化学药物，现在咱口服的药物，比如甲氨蝶呤、来氟米特等等都是小分子的化学药物，它结构单一，生物制剂通常都是生物大分子，是生物蛋白类的药物。
另外，生产方式也是不一样的，传统的化学药物主要是化学合成的，生物制剂是利用新型的生物技术生产出来的，它在生产过程中可能用到刚才提到的一些微生物、细菌等等。
还有就是它具有靶向性治疗的作用。化学药物主要是通过调节发生作用，可能作用于不同的环节，调节B细胞、T细胞增殖的情况。生物制剂针对特定的致病性因子起到靶向性的治疗作用，就有可能阻断疾病的发生和发展的过程。
还有就是治疗效果更加明确，因为它是靶向作用到特定的致病的因子，所以它的治疗效果比传统的药物更加明显。
常见的生物制剂有哪几类？
目前治疗类风湿关节炎的主要的生物制剂就包括这么几类，一类是肿瘤坏死因子拮抗剂，这是大家最熟悉的，目前我们国内有阿达木单抗、英夫利西单抗、依那西普；还有白介素-1的受体拮抗剂，也叫阿那白滞素，主要用于幼年类风湿关节炎，还有就是白介素-6的受体拮抗剂。原来是在北京很多医院，全国多家医院做多家中心的临床观察的，目前已经批准上市了。
