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简述PCR的原理和应用1. PCR简介PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种通过体外扩增DNA 片段的技术，由美国生物学家Kary B. Mullis于1983年发明。
PCR技术的成功应用在分子生物学和遗传学领域取得了革命性的突破，成为现代生物学研究的重要工具之一。
2. PCR的原理PCR技术主要依赖于DNA的体外复制过程，包括三个主要步骤：变性（Denaturation），退火（Annealing）和延伸（Extension）。
以下是PCR的原理概述：•变性（Denaturation）：将待扩增的DNA双链分离，通常通过加热至94-98℃来破坏氢键，使DNA变为单链。
•退火（Annealing）：将DNA的温度降至反应溶液中引物（引导扩增的短DNA序列）的退火温度，使引物与目标DNA序列互补结合。
•延伸（Extension）：在适宜的温度下加入DNA聚合酶（常用的是Taq聚合酶），使引物的3’端延伸，合成新的DNA链。
经过多个PCR循环，每个循环产生的DNA片段会成倍增加，最终得到大量的目标DNA序列。
3. PCR的应用PCR技术在许多领域具有广泛的应用，以下是PCR在不同方面的应用概述：3.1 基因检测和诊断•PCR可以检测和诊断遗传性疾病，例如常见的唐氏综合征、囊性纤维化等。
通过扩增目标基因的特定序列，可以检测是否存在特定的突变或基因缺陷。
•PCR还可用于检测病原微生物的存在，例如检测病毒、细菌和真菌等。
通过扩增目标基因的保守序列，可以确认病原体的存在并进行鉴定。
3.2 法医学应用•PCR技术被广泛应用于法医学领域，可用于识别个体身份和DNA指纹鉴定。
通过扩增特定DNA区域，可以从样本中获得个体独特的遗传特征，如指纹、DNA序列等。
•PCR还可用于研究遗传疾病的家族史，通过扩增特定基因的片段，可以确定家族成员是否遗传了特定的遗传变异。
3.3 生物学研究•PCR技术在基础生物学研究中扮演着重要角色。
PCR的原理和应用领域1. PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。
它是由美国生物学家凯瑟琳·梅利斯（Kary B. Mullis）在1983年发明的，因其在分子生物学领域的重要应用而获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR的原理主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1.1 变性（Denaturation）将待扩增的DNA样品加热至94-98℃，使双链DNA解开成两条单链DNA。
这一步是为了使DNA分子的双链结构完全解链，以便后续的退火步骤。
1.2 退火（Annealing）将待扩增的DNA样品降温至50-65℃，加入引物（寻找特定靶序列的DNA寡核苷酸链），使引物与单链DNA序列互补配对结合。
这一步是为了使引物与待扩增的DNA序列特异性地结合，以启动PCR反应。
1.3 延伸（Extension）将待扩增的DNA样品在72℃下加入DNA聚合酶（如Taq聚合酶），使DNA引物双链结构被DNA聚合酶复制成两条新的DNA双链。
这一步是为了合成新的DNA链，使扩增物数量呈指数倍增。
经过多个循环的变性、退火和延伸步骤，可以在短时间内扩增出大量特定目标序列的DNA片段。
2. PCR的应用领域PCR技术具有高效、灵敏、特异性强等优点，因此在许多领域得到了广泛应用。
2.1 分子生物学研究PCR技术在分子生物学研究中扮演着重要角色，广泛应用于：•基因克隆和表达研究：PCR可以扩增特定基因片段，用于克隆和构建重组DNA。
可以通过PCR检测基因在不同组织和细胞类型中的表达水平，研究基因的功能和调控机制。
•突变检测和基因诊断：PCR可以检测基因突变，用于遗传病的诊断和预测。
例如，PCR可以用于检测致病基因的特定突变，如BRCA1和BRCA2基因突变与乳腺癌的关联。
•DNA指纹和个体识别：PCR可以扩增DNA中的特定序列，用于DNA指纹分析和个体识别。
【分子生物学技术】PCR技术原理与应用PCR技术原理与应用一、实验目的：1、理解PCR的技术原理；2、了解PCR的应用领域二、实验原理：1 概念PCR（Polymerasechain reaction，聚合酶链式反应）是模拟体内DNA复制过程，对特定DNA序列进行大量扩增的一种技术。
PCR 反应是以4种dNTP为底物，引物引导，DNA聚合酶催化作用下，在单链DNA模板3’末端开始进行互补链的延伸，多次反复的扩增使特定DNA序列以指数增加。
2、PCR反应体系参与PCR反应的物质主要为包括：引物、酶、dNTP、Buffer、模板和Mg2+。
2.1 引物引物是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。
PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应. 引物设计一般考虑以下几个方面：2.1.1 引物长度PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。
引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp，最佳为20～24bp。
引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2.1.2 引物碱基构成引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，3′端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
两个引物中（g+c）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（g+c）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%～60%为佳，过高或过低都不利于引发反应。
Tm值是一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸互补双链解链的温度。
Tm=4（G+C）+2（A+T）。
PCR的原理和主要应用1. PCR的原理PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它可以在体外迅速扩增目标DNA序列。
PCR的原理基于DNA聚合酶在体外复制DNA的能力，通过循环反应，可以从一小段DNA模板扩增出大量目标DNA片段。
PCR的原理主要包括三个步骤：变性、引物结合和延伸。
1.1 变性PCR反应开始时，将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开，得到两条单链DNA。
1.2 引物结合将PCR反应体系降温至目标DNA片段的引物结合温度，引物能够特异性地与目标DNA的两端结合。
引物是由两个无定序核苷酸组成，一个与目标DNA的一条链上的末端互补，另一个与另一条链上的末端互补。
1.3 延伸加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），温度升高至DNA聚合酶的最适温度，DNA聚合酶沿着DNA模板逐渐合成新的DNA链。
此步骤的温度通常在72℃左右。
经过多次循环，可以扩增出大量目标DNA片段。
2. PCR的主要应用PCR技术在生物学研究和临床诊断中有广泛的应用。
以下是PCR的主要应用。
2.1 基因克隆PCR可以扩增出目标基因的DNA片段，并通过连接酶和质粒进行连接，从而实现基因的克隆。
基因克隆是研究基因功能和制备重组蛋白等重要实验手段。
2.2 基因检测PCR技术可以用来检测特定基因的存在与否。
通过设计特异性引物，可以选择性地扩增目标基因的DNA片段。
这种检测方法广泛应用于遗传病的检测、疾病相关基因的筛查等。
2.3 遗传多态性分析PCR技术可以用来分析基因座的遗传多态性。
通过选择特异性引物，可以扩增出基因座上的多种等位基因，通过分析扩增产物的长度或序列，可以确定个体在某个基因座上的基因型。
2.4 表达定量PCR技术可以用来分析基因在不同组织或条件下的表达量。
通过选择特异性引物，可以扩增出目标基因的DNA片段，通过比较扩增产物的数量，可以推断出基因在不同条件下的表达量。
2.5 病原体检测PCR技术在疾病的快速诊断中发挥了重要作用。
第二章PCR技术的原理及应用故事发生在1983年的春夏之交很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus 公司工作期间，发明了PCR。
他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。
1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...Mullis 开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA 的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA 聚合酶，面对面地合成着DNA ，……Mullis的第一个PCR实验•1983年9月中旬。
Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。
结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。
于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。
1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。
第一种高温菌DNA聚合酶的分离美国黄石国家公园Thermus aquaticus•Taq•Not permanently destroyed at 94ºC •Optimaltemperature is 72ºC耐高温DNA聚合酶的种类•Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus，Cetus/Roche)•Tth DNA聚合酶(Thermus thermophilus，Toyobo)•Pfu DNA聚合酶（Pyrococcus furiosus，Stratagene）Deep Vent DNA聚合酶(Bio-labs）•Tfl DNA聚合酶（Thermus flavus，Promega)•Tli DNA聚合酶(Thermococcus litoralis，Promega) Vent DNA聚合酶(Bio-labs）•Pwo DNA聚合酶( Pyrococcus woesei，Roche)•Pfx DNA聚合酶(Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen)•Dyna zyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme）•FD DNA聚合酶(Thermus sterophilus？，复旦大学)•Tma, Tne, KOD, ……PCR仪器的变迁•三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）•电加热块＋自来水冷却（PE，1988）•电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）•三个加热块＋机械手（Stratagene，1994）•半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendrof）•温度梯度, 荧光检测(如Roche的Lightcycler)•风加热•Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况•1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）•现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等）PCR的发展史•1983年春，Mullis发展出PCR的概念；•1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；•1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断；•1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；•1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。
•1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；•1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的；•1988年，第一台PCR仪问世；•1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。
PCR不只是一个方法改进•Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；•到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；•Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。
PCR相关的术语和产品层出不穷•T-vector •HotStart Taq •RT-PCR •RAPD-PCR •DDRT-PCR •LM-PCR •Inverse PCR •Nested PCR •Real-time PCR •RACE•Flow chip PCR •TAS•Multiplex PCR •Immuno PCR •Asymmetric PCR •LP-PCR•NASBA •Recombinant PCR •AFLP•SSCP•In situ PCR •TaqMan/SYBR green1st cycle2nd cycle3rd cycle过程变性引物退火DNA 复制（一）PCR的基本原理（二）PCR的种类1.普通PCRPCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4 小时PCR 具有极高的灵敏度污染是PCR实验的常见问题。
只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。
样品正对照负对照标准分子量因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。
用紫外灯破坏污染物也是一个办法（二）PCR的种类2.RT-PCR：反转录PCR(reverse transcriptase-PCR)•原理：RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
•特点：作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物(GSP)中的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
•应用：RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，分析基因的转录水平，细胞中RNA病毒的含量，直接克隆特定基因的cDNA序列。
两步法RT-PCR示意图一步法RT-PCR示意图一步法和两步法RT-PCR的比较两步法RT-PCR一步法RT-PCR起始第一链cDNA合成使用：起始第一链合成使用Oligo(dT)，随机六聚体，GSP引物GSP引物优点优点•灵活•方便引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性•困难RT-PCR的优化能力•高灵敏度•适用于在单个样品中检测几个mRNA•适用于大量样品分析Eco RI寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6mRNA(A)n (T)12-18(A)n(A)n (T)12-18R 6R 6R 6R 6R 6R 6第二链合成(A)n (T)12-18(A)nR 6R 6R 6R 6R 6R 6(A)n (T)12-18Eco RI加上EcoRI 接头，磷酸化，cDNA 分级cDNA 合成完毕，准备连接第一链合成cDNA 合成过程示意图cDNA序列的克隆（二）PCR的种类2.Nested PCR：巢式PCR•原理：利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。
在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。
•优点：由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR （如5'RACE）的特异性。
•应用：一般应用于动物方面。
如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
First PCRSecond PCR Nested PCR原理示意图（二）PCR的种类3.Inverse PCR：反向PCR•原理：用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。
PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。
这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。
•优点：可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。
•应用：一般应用于未知序列的扩增，有时也用于定点突变。
Inverse PCR原理示意图（二）PCR的种类4.PCR-RFLP:多聚酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(restriction fragment length Polymorphism，RFLP)•原理：PCR产物－限制性内切酶切－多态性分析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。
•优点：具有分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观等。
主要用于核酸变异性分析与比较, 微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断等。
•局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变的情况下，一次只能完成一个特定位点突变筛选，检测效率低。
PCR-RFLP原理示意图（一）PCR的种类5.PCR-SSCP：聚合酶链反应一单链构象多态性(single strand conformation polymorphism)•原理：是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。
•特点：刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。
后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。
1993年起用EB染色法显示DNA带型。
优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、不需特殊设备，适用于大样本筛选。
己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。
PCR-SSCP示意图从定性到定量的革命普通PCR定量分析的困惑聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。
在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。
无论定性还是定量分析，分析的都是PCR 终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR 信号放大之前的起始模板量。
