2011!B细胞非霍奇金淋巴瘤患者IgH基因重排检测分析及意义_吴书一

血浆游离DNA IgH和TCRγ基因重排在非霍奇金淋巴瘤患者微小残留病中的应用及临床意义钟凌;黄文芳【摘要】目的检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者外周血血浆游离DNA免疫球蛋白重链(IgH) 基因和T细胞受体γ(TCRγ) 基因克隆性重排,并探讨其在监测微小残留病变(MRD)中的临床意义.方法提取63例NHL患者血浆游离DNA并以Globin 基因确定其存在,通过PCR方法检测IgH (VH FR3-JH)和TCRγ(Vγ-Jγ)克隆性基因重排,与病理组织学检查进行比较.并随访患者以监测和检测MRD.结果 63例中有49例[30例B细胞NHL(B-NHL)和19例T细胞NHL(T-NHL)]初诊、难治或复发的患者血浆游离DNA提取成功.30例确诊的B-NHL患者中IgH基因单克隆重排阳性27例(90%),19例确诊的T-NHL患者中TCRγ基因单克隆重排阳性14例(74%);其病理活检标本基因重排结果分别为87%和74%(P>0.05).另14例(9例B-NHL,5例T-NHL)临床缓解患者中,仅1例(B-NHL)提取出血浆游离DNA并检测到IgH基因单克隆重排.随访治疗缓解的患者共56例,其中24例患者血浆游离DNA基因重排持续阴性,2年存活率达83%;27例患者血浆游离DNA基因重排缓解时呈阴性随后转阳,5例患者缓解后始终能检测到血浆游离DNA基因重排,其2年存活率分别为26%和20%(P<0.05).结论 NHL患者血浆中可以检测出肿瘤源性的血浆游离DNA;NHL患者血浆游离DNA IgH、TCRγ基因重排的检测简单、方便,与病理活检标本检测具有相同的临床意义.在MRD的监测中,利用血浆游离DNA检测单克隆性重排具有一定的早期预测复发的作用.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2010(007)013【总页数】4页(P1312-1315)【关键词】DNA引物;基因重排;免疫球蛋白重链;淋巴瘤,非霍奇金;微小残留病【作者】钟凌;黄文芳【作者单位】四川省医学科学院/四川省人民医院检验科,成都,610072;四川省医学科学院/四川省人民医院检验科,成都,610072【正文语种】中文【中图分类】R392.11;R733.71非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是一种常见的淋巴系统恶性增殖性疾病。

免疫球蛋白重链基因重排检测在原发性胃肠道B细胞非霍奇金淋巴瘤中的应用研究目的探讨多聚酶链反应（PCR）检测免疫球蛋白重链基因重排在原发性胃肠道淋巴组织增生性疾病中的良恶性鉴别中的应用价值。

方法选取存档蜡块45例，采用HE常规染色及SP免疫组化方法进行组织学分类，运用PCR半巢式扩增免疫球蛋白重链基因重排，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

结果IgH FR3A和IgH FR3A+FR2A在MALT淋巴瘤的阳性检测率分别为60.7%（17/28）和75.0%（21/28），在DLBCL中的阳性检测率分别为60.0%（9/15）和73.3%（11/15），在MCL中的阳性检测率分别为100.0%（1/1）和100.0%（1/1）。

IgH FR3A在胃肠道淋巴瘤中的阳性检测率为60.0%。

IgH FR3A联合IgH FR2Ad在胃肠道淋巴瘤中的阳性检出率为73.3%（33/45）。

结论采用PCR方法检测免疫球蛋白重链基因重排能够作为淋巴瘤诊断的有效辅助手段，有助于对原发性胃肠道淋巴组织增生性疾病的良恶性做出正确的诊断。

标签：胃肠道淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；基因重排；多聚酶链反应；免疫球蛋白重链基因[文献标识码]A淋巴瘤是起源于淋巴组织及淋巴结的恶性肿瘤，原发性胃肠道淋巴瘤是结外淋巴瘤的最好发部分。

原发性胃肠道淋巴瘤占结外淋巴瘤的30%～45%。

原发性淋巴瘤由于其临床表现无特殊性，尤其在早期的恶性淋巴瘤由于其更缺乏特异性，因此临床较难做出正确诊断，易造成误诊。

病理诊断淋巴瘤较为可靠，借助形态学和免疫组织化学能对大部分淋巴瘤做出明确的诊断，但对一些疑难病例仍然不能做出正确诊断，未能得到及时的正确诊断不利于临床医生做出最佳的治疗方案和进行必要的预后评估。

近年来，针对淋巴瘤免疫球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排检测已经成为临床上诊断淋巴瘤的一项必要手段，成为鉴别诊断淋巴瘤的一种新的有力工具，本研究对此进行初步研究。

用IgH、TCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变【摘要】目的探讨IgH 、TCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变的意义。

方法采用IgH、TCR β、TCR γ基因重排标志检测，36例经常规HE、免疫组化不能诊断的疑难淋巴组织增生性病变，并进行克隆性分析。

结果29例淋巴组织增生性病变呈克隆阳性，其中IgH、TCR双重排阳性者为13例，IgH单一阳性8例，TCR单阳性为8例。

克隆阳性病例与免疫组化结果一致的为24/29例，7例阴性者，4例为反应性增生，2例经随诊为猫抓病淋巴结炎，1例为不典型增生。

结论 IgH、TCR基因重排技术对于疑难淋巴组织增生性病变的诊断和鉴别诊断有较大的意义。

【关键词】淋巴瘤基因重排;诊断Detecting Problematic Proliferative Lesions of Lymph Tissue by IgH and TCR Gene Rearrangement TechniqueZHONG Mei, LV Ya li, LI Bing, ZHAO PoDepartment of Pathology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, ChinaAbstract：Objective To investigate the significance in diagnosis of problematic proliferative lesions of lymph tissue by IgH, TCR gene rearrangement technique.Methods Thirty six cases of proliferative lesions of lymph tissue with diagnostic difficulty by routine HE and immunohistochemistry, were analyzed in detail by PCR based IgH, TCR gene rearrangement technique to further determine the diagnosis. 20 cases of previously diagnosed lymphoma and 10 reactive lymphadenitis were used as a positive control and negative control, respectively.Results All control samples of lymphoma were positive for clonal rearrangement. 29/36(80.6%)cases of problematic lesion showed positive for clonal proliferation in which those positive for both IgH and TCR were 13/29(44.8%), for single,IgH 8/29(27.6%)or TCR 8/29(27.6%), respectively; and those positivity associated with immunohistochemistry were 24/29(82.8%). In seven cases negative for clonal rearrangement, 4 were reactive proliferation，2 Cat scratch lymphadenitis and 1 atypical proliferation.Conclusion It is significantly useful to solve the problems in differentiating diagnosis of elusive proliferative lesions of lymph tissue, by IgH, TCR gene rearrangement analysis.Key words：Lymphoma; Gene rearrangement; Diagnosis0 引言本研究应用IgH、TCR β、TCR γ基因重排技术对36例疑难淋巴组织增生性病变进行分析，以探讨实际工作中解决疑难问题的可能性及意义。

高通量测序分析B细胞非霍奇金淋巴瘤IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值马强;邹东梅;郭轶先;赵弘;常晓丽;胡蓉华;孙婉玲【期刊名称】《肿瘤防治研究》【年(卷),期】2024(51)5【摘要】目的探讨B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值。

方法收集接受NGS检测,且存在IGH基因存在克隆性重排的55例B-NHL患者的人口学资料、临床资料及IGH基因NGS检测结果,分析IGH基因克隆性重排特点、IGHV基因取用频率,以及NGS检测IGH基因重排在临床中的应用价值。

结果55例患者中,以单个优势克隆为主(85.45%,47/55),少数患者可检测到2个(12.73%,7/55)和3个优势克隆(1.82%,1/55);在IGHV基因取用偏好方面,IGHV3基因在B-NHL中取用频率最高,其次为IGHV4基因;在IGHV亚型中,IGHV3-23在慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)中出现频率最高,IGHV4-34在原发中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤(PCNSL-DLBCL)及弥漫大B细胞淋巴瘤非特指型(DLBCL-NOS)中出现频率最高。

结论不同病理类型的B-NHL患者IGH基因克隆性重排中IGHV基因片段取用频率存在偏好,使用NGS检测IGH重排可以识别亚克隆,鉴定克隆相关性,辅助疾病诊断。

【总页数】5页(P368-372)【作者】马强;邹东梅;郭轶先;赵弘;常晓丽;胡蓉华;孙婉玲【作者单位】首都医科大学宣武医院血液内科【正文语种】中文【中图分类】R551.2【相关文献】1.IgH基因单克隆重排检测及其在B细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用2.血浆游离DNA IgH和TCRγ基因重排在非霍奇金淋巴瘤患者微小残留病中的应用及临床意义3.高通量测序结合捕获技术检测非霍奇金B细胞淋巴瘤中重链基因重排VDJ 区的临床研究4.血浆游离DNA IgH和TCRγ基因克隆性重排在非霍奇金淋巴瘤诊断中的意义5.实时定量PCR检测B细胞非霍奇金淋巴瘤患者外周血和骨髓IgH基因重排及临床意义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

IgH基因单克隆重排检测及其在B细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用李银珍;王芳;邵琼;张旭;邓玲;汤涛;张晓;吴秋良【摘要】AIM: To establish a reliable and feasible protocol for detection of monoclonal immunoglobulin heavy chain (IgH) gene rearrangements for routine diagnosis of B - cell non - Hodgkin lymphoma ( B - NHL). METH-ODS : Using the primer combinations of FR2, FR3, LJH and VLJH, modetube A + tube B, and semi - nested PCR, the monoclonal IgH gene rearrangements in 121 cases of B - NHL, 58 cases of T - cell non - Hodgkin lymphoma ( T - NHL) and 19 cases of reactive lymphoid hyperplasia were detected. The differences of clonality detection rate between B - NHLgroup and T - NHL group, B - NHL group and reactive lymphoid hyperplasia group, and between the use of FR2, FR3 and FR2 + FR3primers were analyzed. RESULTS: The clonality detection rates of B - NHL, T - NHL and reactive lymphoid hyperplasia were 81% (96/118), 4% (2/54)and 0% (0/19). There were remarkable differences between B - NHL group and T - NHL group, B - NHL group and reactive lymphoid hyperplasiagroup in monoclonal IgH gene rearrangements ( P < 0. 05 ) . In B - NHL group, monoclonality was found in 58% of the cases using primer FR2, 55% using FR3 , andrn81% using the combination of both primers, with significant differences (P <0. 05) . CONCLUSION: Using the primer combinations of FR2, FR3 , LJH and VLJH, detection of paraffin - embedded tissues, the method of tube A + tube B mode and semi -nested PCR for determining monoclonal IgH gene rearrangements is feasible and reliable, and the clonality de-tection rate is high enough for clinical diagnosis of B - NHL.%目的:建立准确可靠、操作性强、适用于临床实际工作的免疫球蛋白重链(immunoglobulin heavy chain,IgH)基因单克隆重排检测方法,用于B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphoma,B-NHL)的辅助诊断.方法:采用骨架区(framework region,FR)引物FR2、FR3和重链连接区(joining region of heavy chain,JH)引物LJH、VLJH组合、A管+B管模式、半巢式聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法对121例B-NHL、58例T细胞性非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-Hodgkin lymphoma,T-NHL)和19例淋巴结反应性增生的石蜡组织进行IgH基因单克隆重排检测,分析IgH基因单克隆重排检出率在B-NHL组、T-NHL组和淋巴结反应性增生组中的差异,以及B-NHL中联合应用FR2和FR3与单独应用FR2、FR3之间IgH基因单克隆重排检出率的差异.结果:118例成功检测的B-NHL中,IgH基因单克隆重排检出率为81%(96/118);54例成功检测的T-NHL中,IgH基因单克隆重排检出率为4%(2/54);19例成功检测的淋巴结反应性增生中未检出IgH基因单克隆重排.B-NHL组与T-NHL组、淋巴结反应性增生组相比,IgH基因单克隆重排检出率差异具有显著性(P<0.05).B-NHL中,FR2基因单克隆重排检出率为58%(68/118),FR3基因单克隆重排检出率为55%(65/118),联合应用FR2和FR3,IgH基因单克隆重排检出率为81%(96/118),联合应用FR2和FR3与单独应用FR2、FR3的检出率有显著差异(P<0.05).结论:采用FR2、FR3、LJH及VLJH引物组合、A管+B管模式和半巢式PCR法进行石蜡组织IgH基因单克隆重排检测,简单易行,结果准确可靠,阳性率较高,可用于临床B-NHL的辅助诊断.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)011【总页数】5页(P1994-1998)【关键词】淋巴瘤;免疫球蛋白;基因重排【作者】李银珍;王芳;邵琼;张旭;邓玲;汤涛;张晓;吴秋良【作者单位】华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心病理科,广东,广州,510060【正文语种】中文【中图分类】R733.4免疫球蛋白重链(immunoglobulin heavy chain，IgH)基因单克隆重排是B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B－cell non－Hodgkin lymphoma，B－NHL)的重要特征，国内外病理界已达成一致共识:应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术检测IgH基因单克隆重排可以辅助诊断BNHL[1－3]。

Bc-l 2/Ig H 和IgH 基因重排与非霍奇金淋巴瘤诊断和化疗效果的相关性研究1 通讯作者,E -m a i :l huc hang l u @csc o .org .cn2 230000 安徽省遗传中心3 230000 合肥市第一人民医院肿瘤科230000 合肥 安徽医科大学附属省立医院肿瘤科施姗姗,胡长路1,余元勋2,李 娟3=摘 要> 目的:通过对Bc -l 2/IgH 及Ig H 基因重排的联合检测,探讨两种标志物与B 细胞型非霍奇金淋巴瘤(B -NHL )诊断与疗效的相关性。

方法:对49例初治的B -NHL 患者采用以C HOP 方案为基础的化疗,在化疗前及化疗后6周期时以PCR 一步法进行上述指标的检测。

结果:化疗前49例患者的Bc-l 2/Ig H 和IgH 基因重排联合检测率达到9118%,治疗后达到CR 的21例病例中,4例IgH 基因重排转阴,2例Bc-l 2/Ig H 转阴。

结论:Bc-l 2/Ig H 联合IgH 基因重排检测作为分子学标志物比单纯采用Bc-l 2/IgH 或是单纯Ig H 重排更为敏感,但是取得CR 的病例中,Bc-l 2/Ig H 和Ig H 基因重排在化疗前后无明显变化,提示短期内对于临床CR 的患者,上述指标不能做为适时的分子学指标。

=关键词> 非霍奇金淋巴瘤; Bc -l 2/IgH; Ig H; 基因重排; 诊断中图分类号:R 73311 文献标识码:A 文章编号:1009-0460(2009)01-0055-04The st udy of relationship bet wee n Bc-l 2/Ig H ,Ig H gene rearrange m e nt and t he diagnosis and che m ot herapy effect of B -NHLSH I Shan-s han,H U Chang-lu,YU Yuan-xun ,LI Juan.D epart m ent o f Onco logy,t h e Affiliated P rovinceH os -p ital ,AnhuiM edical University ,H efei 230000,ChinaCorres p onding author :H U Chang-lu,E-m ail :huchanglu @csco =Abstract > O bjective :T o observed the B c-l 2/Ig H and Ig H gene rea rrangement i n o rde r to i m prove t he positive ratio o fm olecu -lar diagnosis and kno w t he re l a tionsh i p w ith che m otherapy effect .M ethods :T he po l ym erase cha i n reaction was used to test t he Bc -l 2/Ig H,Ig H gene rearrangem ent o f 49B -NH L pa ti ents w ho are accep ted t he first therapy.Resu lts :The ra ti o o f the comb i ned de tecti on w as 9118%,and there are 4cases the Ig H gene rearrange m ent darkened and 2cases B c-l 2/IgH rearrang e m ent darkened i n t he 21ca -ses unde rgo i ng the therapy w ho ge t to comp l ete re lieve .Conclusion :T he comb i ned de tecti on i s m ore sensitive than the s i ng le m arker .T here is no apparent chang i ng in the casesw hich com es to the co m plete relieve ,and the nu m erator m arker i s no t adap ted to as the grant m arker i n the sho rt ti m e to response the prognos i s for the pa ti ents who get to co m plete re lieve .=K eyW ords > N on -H odgk i n l ymphom a ; B c-l 2/Ig H gene ; Ig H gene ; G ene rearrang e m ent ; D i agno si s 目前,非霍奇金淋巴瘤(NHL )的发病率呈逐步上升的趋势。

IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的的诊断价值目的：探讨IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤的中的诊断价值。

方法：用PCR凝胶电泳检测B细胞非霍奇金淋巴瘤中IgH基因克隆性重排。

结果：43例B细胞非霍奇金淋巴瘤中，39例用FR3A引物检测阳性，阳性率90.7%；22例用FR2A引物检测阳性，阳性率55.2%；FR3A或者FR2A引物联合检测的总阳性率为90.7%。

结论：PCR凝胶电泳技术检测IgH基因克隆重排对B细胞非霍奇金淋巴瘤的诊断有重要的辅助价值。

标签：B细胞非霍奇金淋巴瘤IgH基因克隆重排淋巴瘤作为我国常见恶性肿瘤之一，从分子病理学和分子遗传学水平来探讨相关基因的特征和发病机制，以期建立相应的分子标记，进一步协助诊断、判断预后[1-2]。

淋巴瘤组织学形态多样，免疫组化染色可鉴定淋巴瘤的类型，但无法解决良恶性鉴别难题。

近年来，国外用分子生物学技术证实，细胞增殖的单克隆性可协助肿瘤的诊断。

本研究应用PC R方法检测B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中免疫球蛋白重链（IgH）基因重排情况，探讨其在淋巴瘤诊断中的价值。

胚系状态下，IgH基因由可变区（V）、多变区（D）、连接区（J ）、恒定区（C）构成。

这些区域在染色体上分布是不连续，片断之间可有长度不等的插入序列将其分开，当淋巴细胞发育到一定阶段，在重组酶的作用下，重新排列组合构成一个有结构的基因，即所谓的基因重排。

正常B淋巴细胞免疫球蛋白重链（IgH ）基因重排为多克隆性，而恶性B细胞肿瘤表现为单克隆性。

因此，这种单克隆IgH 基因重排可用于B细胞淋巴瘤的诊断，对鉴别良、恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值[3-5]。

1. 材料与方法1.1. 标本来源收集浙江大学附属医院，温州医学院2010-2013年间诊断的B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）石蜡标本43例，男性24例，女性19例，年龄17-75岁，平均年龄为52岁。

其中弥漫大B淋巴瘤（DLBCL ）30例，滤泡性淋巴瘤（FL）4例，粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）4例，套细胞淋巴瘤（MCL）3例，小细胞淋巴瘤（SLL/CLL）2例。

B细胞非霍奇金淋巴瘤患者IgH基因重排检测分析及意义吴书一1，秦亚溱2，刘文刚1，熊灵军3，刘艳荣21．郑州市第三人民医院干细胞与器官移植实验室，郑州450000；2．北京大学人民医院血液病研究所，北京100044；3．郑州大学第二附属医院摘要：目的探讨外周血和骨髓免疫球蛋白重链（Immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排检测方法及其在监测B细胞非霍奇金淋巴瘤（B－NHL）患者微小残留病（Minimal residual disease，MRD）中的临床意义。

方法应用PCR－SSP方法对B－NHL患者进行IgH基因重排检测，回顾性分析39例B－NHL患者IgH基因重排动态检测结果来了解其与临床MRD的关系。

结果39例B－NHL初诊未经治疗患者IgH基因重排检测34例阳性，阳性率87.1%（34/39）。

34例初诊阳性患者，治疗后19例达到临床完全缓解的患者中16例IgH基因重排转阴，3例持续阳性；15例临床部分缓解者，IgH基因重排持续阳性。

分析发现13例患者骨髓和外周血标本IgH基因重排均呈阳性。

结论IgH基因重排检测可以作为B－NHL的辅助诊断及其微小残留病的监测。

关键词：免疫球蛋白重链；基因重排；B细胞非霍奇金淋巴瘤中图分类号：R733.1文献标识码：A文章编号：1672-3422（2011）03-0072-03Clinical significance of immunoglobulin heavy chaingene rearrangement in patients with B－Cellnon－Hodgkin’s lymphomaWU Shu－yi，QIN Ya－zhen，LIU Wen－gang，XIONG Ling－jun，LIU Yan－rongLaboratory of Stem Cell and Organ Transplantation，Zhengzhouthe Third People’s Hospital，Zhengzhou450000，ChinaABSTRACT Objective To explore the methods of detection and clinical significance of immuno-globulin heavy chain gene rearrangement in patient with B－cell non－Hodgkin’s lymphoma（B－NHL）．Methods Detect IgH gene rearrangements of39B－cell non－Hodgkin’s lymphoma cases u-sing polymerase chain reaction/sequence－specific primers and monitoring of these gene rearrange-ments．Results Totally39cases of B－NHL without the treatment of newly diagnosed patients with IgH gene rearrangements detected34cases of positive，positive rate of87.1%（34/39）．34cases of newly diagnosed patients with positive，after treatment19patients achieve complete clinical remission，16cases in which negative，3cases of continuous positive．15cases were partial remission，IgH gene rearrangement continued positive．Conclusions IgH gene rearrangement can be detected as a B－NHL diagnosis and monitoring of minimal residual disease．KEY WORDS Immunoglobulin heavy chain（IgH）；Gene rearrangement；B－cell non－Hodgkin’s lymphoma（B－NHL）淋巴瘤是一种原发于淋巴结及其他淋巴组织的恶性肿瘤，其细胞的恶性克隆表现为多种基因异常，克隆性免疫球蛋白重链（Immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排被认为是B淋巴细胞克隆性增生的特异性标记之一，可作为B细胞非霍奇金淋巴瘤（B－NHL）的临床诊断和监测微小残留病（Minimal residual disease，MRD）的标志分子［1］。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910239234.4(22)申请日 2019.03.27(71)申请人 上海科医联创医学检验所有限公司地址 200120 上海市浦东新区紫萍路908弄5号2层(72)发明人 曹金良　齐善康　崔展飞　康晓婷　(74)专利代理机构 上海申新律师事务所 31272代理人 俞涤炯(51)Int.Cl.C12Q 1/6869(2018.01)C12Q 1/6886(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法(57)摘要本发明涉及一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法，其包括：根据已知的IGH基因序列设计及合成扩增引物，对扩增片段进行多重扩增反应，获得IGH扩增引物；对IGH扩增产物进行纯化，并进行末端修饰；将修饰后的扩增产物与高通量测序平台的接头进行连接并进行连接修复、纯化，得到高通量测序文库；上机测序及数据分析；其中，所述扩增引物包括设计位置分别位于FR1、FR2和FR3区域的正向引物和设计位置位于J 区的反向引物。

本发明还涉及用于IGH基因重排的高通量测序检测的试剂盒和系统。

本发明采用高通量测序的手段检测IGH基因重排，可以极大的提高检测灵敏度及准确性，并且可以准确地得到单克隆序列信息，具有广泛的应用前景。

权利要求书1页 说明书14页序列表15页 附图3页CN 109929924 A 2019.06.25C N 109929924A1.一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1)根据已知的IGH基因序列，设计及合成扩增引物；步骤2)采用扩增引物对扩增片段进行多重扩增反应，获得IGH扩增引物；步骤3)对IGH扩增产物进行纯化，并对纯化后的产物进行末端修饰；步骤4)将修饰后的扩增产物与高通量测序平台的接头进行连接并进行连接修复，对连接修复产物进行纯化，得到高通量测序文库；步骤5)将高通量测序文库上机测序及数据分析；其中，所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的设计位置分别位于FR1、FR2和FR3区域，所述反向引物的设计位置位于保守区J区。

非霍奇金淋巴瘤患者外周血及骨髓中免疫球蛋白、T 细胞受体基因重排检测的意义丁士华;熊述道;翟志敏;秦慧;陶莉莉【摘要】目的：探讨非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者骨髓及外周血中免疫球蛋白（Ig）、T细胞受体（TCR）基因单克隆重排检测的临床意义。

方法以BIOMED-2引物系统及多重PCR方法对60例NHL患者骨髓或外周血标本进行Ig及TCR基因重排检测。

结果 B细胞NHL中，39．02％检出Ig基因单克隆重排，T细胞NHL中36．84％检出TCR基因单克隆重排；14例早期与46例晚期患者的Ig和（或） TCR 基因单克隆重排阳性率分别为28．57％和41．3％；11例低变恶性患者和49例中、高度恶性患者的Ig和（或） TCR基因单克隆重排阳性率分别为36．36％和38．78％；以上两者间比较差异均无统计学意义（ P均＞0．05）。

53例NHL患者骨髓涂片检测骨髓侵犯阳性率为13．21％，明显低于骨髓基因重排检测阳性率（43．40％），两者比较差异有统计学意义（P＜0．05）。

结论骨髓及外周血Ig及TCR基因重排PCR检测有助于早期发现骨髓侵犯及MRD。

【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2015(000)005【总页数】3页(P34-36)【关键词】淋巴瘤,非霍奇金;聚合酶链反应;免疫球蛋白;T细胞受体;基因重排【作者】丁士华;熊述道;翟志敏;秦慧;陶莉莉【作者单位】安徽医科大学第二附属医院，合肥230061;安徽医科大学第二附属医院，合肥230061;安徽医科大学第二附属医院，合肥230061;安徽医科大学第二附属医院，合肥230061;安徽医科大学第二附属医院，合肥230061【正文语种】中文【中图分类】R733.4淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其抗原受体通过基因重排形成有功能的基因。

1个T、B细胞或其克隆性后代均只含1种独特的分子遗传学标记，一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化，即可呈现特异的基因重排［1］。

ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．０９．１３·研究生园地·免疫球蛋白基因重排在Ｂ细胞非霍奇金淋巴瘤诊断中的意义卢峰１，罗志刚１，李甫罡１，王钢１，陈涛１，郭晓兰２（１．简阳市人民医院中心实验室，四川简阳６４１４００；２．川北医学院附属医院检验科，四川南充６３７１００）摘要：目的　探讨骨髓及外周血免疫球蛋白（Ｉｇ）基因重排在Ｂ细胞非霍奇金淋巴瘤（Ｂ ＮＨＬ）诊断中的临床意义。

方法　采用多重聚合酶链反应（ｍＰＣＲ）技术并根据ＢＩＯＭＥＤ ２引物系统对１０３例Ｂ ＮＨＬ患者及２０例反应性淋巴组织增生患者骨髓及外周血标本基因组ＤＮＡ进行扩增，对ＰＣＲ产物进行ＩｇＨ、ＩｇＫ基因重排的克隆性分析。

结果　１０３例Ｂ ＮＨＬ患者中ＩｇＨ和ＩｇＫ单克隆重排阳性率分别为４１．７％和５０．５％，ＩｇＨ和ＩｇＫ联合检出率为６４．１％。

５９例慢性淋巴细胞白血病（ＣＬＬ）／小Ｂ细胞淋巴瘤（ＳＬＬ）患者中共检出Ｉｇ基因单克隆重排４９例（８３．１％）；除ＣＬＬ／ＳＬＬ以外的其他４４例Ｂ ＮＨＬ患者中有１７例（３８．６％）检出Ｉｇ基因单克隆重排，而在２０例反应性淋巴组织增生患者中均未检出。

７０例Ｂ ＮＨＬ患者外周血标本Ｉｇ基因重排检出率与骨髓标本之间的差异无统计学意义（４５．７％ｖｓ５４．３％，χ２＝１．０３，Ｐ＝０．３１）；２６例ＣＬＬ／ＳＬＬ患者外周血Ｉｇ基因重排率与骨髓标本之间的差异无统计学意义（６９．２％ｖｓ８０．８％，χ２＝０．９２，Ｐ＝０．３４）；４４例非ＣＬＬ／ＳＬＬ患者外周血Ｉｇ基因重排率与骨髓标本之间的差异亦无统计学意义（３１．８％ｖｓ３８．６％，χ２＝０．４５，Ｐ＝０．５０）。

结论　Ｉｇ基因重排可用于Ｂ ＮＨＬ的临床诊断，外周血与骨髓Ｉｇ基因重排检测具有同等的诊断价值。

关键词：Ｂ细胞非霍奇金淋巴瘤；Ｉｇ基因重排；ＢＩＯＭＥＤ ２引物系统中图分类号：Ｒ４４６．１１ 文献标志码：Ａ Ｂ细胞非霍奇金淋巴瘤（Ｂ ＮＨＬ）是非霍奇金淋巴瘤中常见的一种类型（约占８０％）［１］。

高通量测序结合捕获技术检测非霍奇金B细胞淋巴瘤中重链基因重排VDJ区的临床研究马超，孙璐，赵瑜，薄剑［摘要］目的探讨高通量测序(Next-Generation Sequencing,NGS)结合基因捕获技术检测非霍奇金B细胞淋巴瘤中免疫球蛋白重链基因(Immunoglobulin heavy chain gene,IgH)重排的临床应用。

方法收集2019年3月至2020年5月在中国人民解放军总医院第一医学中心治疗的15例成熟B细胞淋巴瘤病例，包括11例弥漫大B细胞淋巴瘤,1例滤泡性淋巴瘤,2例边缘区淋巴瘤，1例边缘区淋巴瘤伴局部弥漫大B转化淋巴瘤。

采集其初诊时的组织样本与血浆样本，通过NGS检测IgH重排，并分析其与临床病理特征的相关性。

结果在组织样本中，平均检出11212条唯一的互补决定区3(Complementarity Determining Region3,CDR3)序歹U,范围从515到41476条;在血浆样本中，平均检出1689条唯一的CDR3序列，范围从238到6499条。

在73.3%(11/15)的患者组织中检出特异性寡克隆扩增，在其对应的血浆样本中,72.7%(8/11)存在组织中的特异性寡克隆，并且二者的比例显著相关(Spearman rho=0.803,P=0.003)。

另外,存在特异性寡克隆的组织样本中,克隆指数显著高于没有特异性寡克隆的样本(P<0.05),表明存在特异性寡克隆的样本的IgH重排多样性较低。

现有数据尚未发现克隆指数及组织中特异性寡克隆数与各项临床病理指标存在显著相关性。

结论通过NGS检测非霍奇金B细胞淋巴患者的IgH重排，可以有效获得具体量化的CDR3序列，全面评估克隆多样性，并在大部分样本中得到特异性寡克隆序列。

血浆检测结果与组织中的结果显著相关，可用于后续微小病灶残留的检测与复发监测。

［关键词］非霍奇金B细胞淋巴瘤；免疫球蛋白重链基因；重排；高通量测序［中图分类号］R733.4［文献标志码］A［文章编号］2095-3097(2020)06-0378-06doi:10.3969/j.issn.2095-3097.2020.06.013Clinical Significance of Next Generation Sequencing for Detecting Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene in Patients with non-Hodgkin B Cell Lymphoma伽Chao1,SUN Lu2,ZH4。

基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用(一)作者：朱少君，李艳红，张伟，王旭霞，巩丽，李爱宁,兰淼【关键词】淋巴瘤Detectionandclinicalsignificanceofgenerearrangementsindiagnosisoflymph omas【Abstract】AIM:ToestablishawaytodetectthegenerearrangementsofIgHandTCRandtoas sesstheapplicationofthedetectiontechniqueinthediagnosisofmalignantlym phoma.METHODS:Fiftythreecasesofmalignantlymphomaand20casesofreac tivelymphoidhyperplasiawerechosenformakingtissuesections.GenomicDN Awasextracted,andamplifiedviaPCR.Theproductswereresolvedondenaturin gpolyacrylamidegelsandvisualizedthroughsilverstaining.RESULTS:Generearr angementsofIgHandTCRwerenegativein20casesofreactivelymphoidhyperpl asia.Inallof18casesofTcellnonHodgkinslymphoma(TNHL),generearrangeme ntofTCRγwasfoundin12casesandthatofTCRβwasfoundin3cases,andIgHgene rearrangementwasnotfound.IgHgenerearrangementwasfoundin28casesou tof32casesofBcellNHL(BNHL),in2casesofwhichgenerearrangementsofTCRγa ndIgHwerebothfound.TherewasIgHgenerearrangementin3casesofsuspecte dlymphomas.TherewasaremarkabledifferencebetweenNHLgroupandbenig ngroupingenerearrangment(P0.05).CONCLUSION:Thedetectionofgenerearr angementsofIgHandTCRbyPCRcanbeakindofsubsidiarymeanstodiagnosethelymphoproliferativedisease.Particularly,theclonalityshowedintheformalinf ixedandparaffinembeddedsamplesmaybeusefulintheretrospectiveresearch es.【Keywords】lymphoma;generearrangement;polymerasechainreaction;neoplasm【摘要】目的：建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨B淋巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用.方法：从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果.结果：20例良性淋巴组织反应性增生病例中,淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性；18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCRγ基因重排12例,TCRβ基因重排3例，未见有IgH基因重排；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,有2例TCRγ和IgH基因重排均阳性；3例未确诊的疑难病例均为IgH 基因重排；IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间，差异有显著意义(P0.05).结论：应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；肿瘤0引言恶性淋巴瘤(malignantlymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤,主要发生于淋巴器官和淋巴组织.根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病（Hodgkinsdisease,HD）及非何杰金恶性淋巴瘤（nonHodgkinsmalignantlymphoma,NHL），淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难.淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟,其抗原受体(Ig和TCR)基因通过基因重排而形成有功能的基因.一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记.一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化,即可呈现特异的基因重排〔1〕.因此,对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断.此研究拟应用这一手段，探讨淋巴组织增生性病变的性质，并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊断价值进行探讨. 1材料和方法1.1材料53例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医大学唐都医院病理科（1995~2005）.其中男性29例（55%），女性24例（45%）；年龄12~76岁，平均年龄44.2岁.所有标本均为福尔马林固定、石蜡包埋组织.其中B细胞非何杰金淋巴瘤32例，T细胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴组织增生性病变3例.20例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴性对照.所有淋巴瘤病例均在取PCR模板前经临床病理HE和免疫组化标记（B细胞:CD20,CD79α;T细胞:CD3,CD45RO）证实，以确定为相应病例且所取部位确为病变部位，包含有需检测的部分.3例未能定性的淋巴组织增生性病变怀疑为BNHL(免疫组化标记CD79α阳性),但诊断仍未明确.1.2方法1.2.1石蜡包埋组织DNA的提取每例标本制备厚度为4μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、乙醇冲洗，切片自然干燥.用无菌双面刀片将组织刮入1.5mL的离心管中，按以前的方法〔2-3〕提取基因组DNA.1.2.2引物合成引物序列由上海生工生物工程技术公司合成.引物序列为:β球蛋白基因内对照PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC，PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC；免疫球蛋白基因重排(IgH)FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT，LJH：TGAGGAGACGGTGACC，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG；T细胞受体基因重排(TCRβ链和γ链)Db1:CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC，Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，TVG:AGGGTTGTGTTGGAATCAGG，TJX:CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC，Vγ11:TCTGGAGTCTATTACTGTGC，Vγ101:CTCACACTCTCACTTC，Jγ12:CAAGTGTTGTTCCACTGCC，Jp12:GTTACTATGAGCTAGTCC.1.2.3PCR扩增及循环条件PCR扩增在PT200型热循环仪（MJResearch）上进行.反应体系为25μL，含10mmol/LdNTP（GibcoBRL）2μL，10×缓冲液2.5μL，50mmol/LMgCl20.75μL，TaqDNA聚合酶（GibcoBRL）1U，20pmol/L引物1μL，DNA样品1~5μL.IgH基因采用半巢氏PCR扩增:第一轮引物为FR3A和LJH,95℃预变性3min,然后94℃变性40s,62℃退火50s,72℃延伸40s,共30个循环;最后72℃延伸10min.扩增产物经1∶100稀释后取1μL进行第二轮扩增,引物为FR3A和VLJH,95℃预变性3min,然后94℃变性40s,60℃退火50s,72℃延伸40s,共30个循环;最后72℃延伸10min.FR3A与VLJH扩增产物为100～120bp.TCRβ和TCRγ采用40个循环,其中TCRγ引物为Vγ11，Vγ101和Jγ12或Vγ11，Vγ101和Jp12的混合物.95℃预变性3min,然后94℃变性40s,56℃退火50s,72℃延伸40s；最后72℃延伸10min.TCRβ扩增产物为65～85bp.TCRγ各组扩增产物在70～200bp不等.β球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠,共40个循环.95℃预变性3min，然后94℃变性40s,60℃退火50s,72℃延伸40s；最后72℃延伸10min.产物长度为110bp.1.2.4电泳及结果观察琼脂糖凝胶（20g/L）电泳评价扩增效果后，将3μL 产物和等体积的上样缓冲液〔4〕（990mL/L甲酰胺，1g/L溴酚蓝，1g/L 二甲苯青）混匀后加到厚度为0.8mm的聚丙烯酰胺凝胶（100g/L，含尿素8mol/L），应用miniVE系统（AmershamPharmaciaBiotech）泳动8h（80V）.取出后按以前的方法〔2〕银染，分别用UVP凝胶分析系统（UVP,Cambridge，UK）和光学照相记录数据，根据IgH及TCR相应阳性位置判断结果.1.2.5结果判定阳性结果判定标准：①PCR扩增电泳条带清晰，宽度不大于1mm，边缘锐利；②片段大小与预计范围相符,与期望值相差不超过5bp；③若出现期望值大小之外的其他条带或期望值内出现两条或以上可接受的条带，应判定为重排阴性.统计学处理：采用SPSS10.0统计分析软件对组间率的差别进行χ2检验,以P0.05为有统计学意义.。

淋巴细胞恶性增殖病基因重排及其意义刘永昌;郭素堂;刘清俊;孙俊宁;何霭【期刊名称】《临床血液学杂志》【年(卷),期】1999(12)6【摘要】目的：对淋巴细胞恶性增殖病进行研究。

方法：应用多聚酶链反应－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＣＲ－ＰＡＧＥ）和银染色法，对３０７例淋巴细胞恶性增殖病进行了免疫球蛋白重链基因（ＩＧＨ），Ｔ细胞受体ｒ链基因（ＴＣＲｒ）的克隆性重排进行检测。

结果：ＩＧＨ１６０例（５２．１％），ＴＣＲｒ５８例（１８８％），双阳性２２例（７．１％），阴性６７例（２１．８％）。

非霍奇金淋巴瘤（ＮＨＬ）与ＮＨＬ白血病的基因重排分布相似；霍奇金淋巴瘤（ＨＤ）明显较低；急性淋巴细胞性白血病（ＡＬＬ）及多发性骨髓瘤（ＭＭ）进展期基因重排高达９５％，９０％；缓解期６０％，４５％；慢性淋巴细胞性白血病（ＣＬＬ）重排率低；急性粒细胞性白血病（ＡＭＬ）及慢性粒细胞性白血病（ＣＭＬ）为对照，它们也有少量淋巴细胞基因重排。

病理学型别以不能分型者，原发灶以鼻及咽淋巴环者之ＴＣＲｒ重排明显增高，且与恶性程度呈正相关。

并可以此重排来检测微小病灶（ＭＲＤ）之存在。

结论：可用此指导化疗。

【总页数】4页(P247-250)【关键词】非霍奇金淋巴瘤;IGH;微小残留病灶;TCRr;病理【作者】刘永昌;郭素堂;刘清俊;孙俊宁;何霭【作者单位】山西省肿瘤研究所;山西省肿瘤医院【正文语种】中文【中图分类】R733.1【相关文献】1.用PCR检测恶性B淋巴细胞的增殖病基因重排 [J], 王鲁群;张明珙2.成人急性T淋巴细胞白血病T淋巴细胞受体β链基因重排的特点及其在微小残留病定量检测中的意义 [J], 姚利;陈子兴;岑建农;梁建英;冯宇锋;刘红;吴德沛3.用PCR检测淋巴结细胞基因重排对淋巴细胞增殖病的诊断意义 [J], 王鲁群;马晓星;迟翠芳;张明珙;宋素芹4.基因重排对淋巴细胞恶性增殖性疾病的诊断价值 [J], 郭宏强;张明智;王贵叶;范翠珍;范魁生5.急性淋巴细胞白血病AML1基因重排与MLL基因丢失同时出现临床意义的探讨[J], 张丽君;王艳萍;卢香兰;何娟;李艳;翟明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

惰性B细胞非霍奇金淋巴瘤与肝炎病毒感染相关性分析刘薇;熊文婕;李姮;刘慧敏;李增军;吕瑞;邱录贵;易树华【期刊名称】《中国肿瘤临床》【年(卷),期】2016(043)011【摘要】目的：分析惰性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL）不同亚型患者乙型肝炎病毒（hepatitis B vi⁃rus，HBV）及丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染的情况，探讨惰性B-NHL不同亚型与肝炎病毒感染的相关性。

方法：回顾性分析中国医学科学院血液病医院1994年1月至2014年1月收治的733例初诊惰性B-NHL患者的肝炎病毒感染资料。

与全国一般人群相对照，比较惰性B-NHL患者与全国一般人群肝炎病毒感染的差异。

比较分析惰性B-NHL各亚型患者肝炎病毒感染的情况，并探讨其相关性。

结果：733例惰性B-NHL患者乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBs-Ag）阳性率为7.9%，与全国一般人群比较，差异无统计学意义（7.9%vs.7.2%，P=0.548）。

在惰性B-NHL中，脾边缘区淋巴瘤（splenic marginal zone lympho⁃ma，SMZL）48例，HBs-Ag阳性率为18.8%，明显高于全国一般人群（18.8%vs.7.2%，P=0.002）、其他惰性B-NHL（18.8%vs.7.2%， P=0.004）及其他边缘区淋巴瘤（marginal zone lymphoma，MZL）患者（18.8%vs.7.1%，P=0.005）。

惰性B-NHL其他亚型患者HBs-Ag阳性率比较全国一般人群，差异均无统计学意义（P>0.05）。

在HBs-Ag阳性患者中，乙肝“大三阳”在惰性B-NHL不同亚型中无显著性差异，但乙肝“小三阳”在SMZL组占16.7%，明显高于其他惰性B-NHL组（16.7%vs.4.7%，P<0.001）。