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大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。
大豆制品中尿素酶活性测定方法1 适用范围本标准适用于由大豆制得的产品和副产品中尿素酶活性的测定。
本法可确认大豆制品的湿热处理程度。
2 定义本标准所指尿素酶活性定义如下：在30±0.5℃和pH7的条件下, 每分钟每克大豆制品分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
3 原理将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min, 尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。
用过量盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。
4 仪器设备4.1 样品筛: 孔径200μm;4.2 酸度计: 精度0.02pH, 附有磁力搅拌器和滴定装置;4.3 恒温水浴: 可控温30±0.5℃;4.4 试管: 直径18mm, 长150mm, 有磨口塞子;4.5 精密计时器;4.6 粉碎机: 粉碎时应不生强热(例如球磨机)4.7 分析天平: 感量0.1mg;4.8 移液管: 10ml。
5 试剂和溶液5.1 尿素(GB 696-77): 分析纯;5.2 磷酸氢二钠(GB 1263-77): 分析纯;5.3 磷酸二氢钾(GB 1274-77): 分析纯;5.4 尿素缓冲溶液(pH6.9至7.0): 4.45g磷酸氢二钠(5.2)和3.40g磷酸二氢钾(5.3)溶于水并稀释至1000ml, 再将30g尿素(5.1)溶于此缓冲溶液中, 可保存1个月。
5.5 盐酸(GB 622-77): 分析纯, 0.1M溶液;5.6 氢氧化钠(GB 629-77): 分析纯, 0.1M标准溶液, 按GB 601标准溶液制备方法的规定配制。
6 试样的制备用粉碎机(4.6)将10g试样粉碎, 使之全部通过样品筛(4.1)。
对特殊试样（水分或挥发物含量较高而无法粉碎的产品）应先在实验室温度下进行预干燥，再进行粉碎，当计算结果时应将干燥失重计算在内。
7 测定步骤称取约0.2g已粉碎的试样, 称准至0.1mg, 转入试管(4.4)中(如活性很高只称0.05g试样)移入10ml尿素缓冲溶液(5.4), 立即盖好试管并剧烈摇动, 马上置于30±0.5℃恒温水浴(4.3)中, 准确计时保持30min。
大豆制品中尿素酶活性测定方法中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法ZBX66030-87Measurementofproteinaseactivity本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1福林法试剂及溶液:以下试剂都为分析纯福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。
冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2CO3),定容至1000mL。
三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CCL3COOH),定容至1000mL。
磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),定容至1000mL,即成溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),定容至1000mL,即成溶液(B液)。
取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成的磷酸盐缓冲液。
2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至,加入氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸,逐步加入6mL1N盐酸使溶解,用盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。
不同方法测定大豆脲酶活性的比较研究杨奇慧舒璐钟剑锋摘要：用滴定法和增值法测定大豆粉在85℃和140℃下分别热处理0、45、90、135、180min的脲酶活性，并用0.2%KOH溶解法测定大豆粉在不同热处理下的蛋白质溶解度。
结果表明：在85℃条件下，处理0～180min 大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着时间延长无明显变化；而在140℃条件下，大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着处理时间的延长显著降低。
通过测定结果可见，同一样品用滴定法和增值法测得的脲酶活性在数值上不相等，不能互用，但蛋白质溶解度更能反映大豆粉受热过度的程度。
关键词：大豆粉；脲酶活性；蛋白质溶解度；pH增值法；滴定法众所周知，大豆含有较丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等，是饲料生产中主要的植物蛋白质源之一，具有较高营养价值。
但是，大豆中含有多种抗营养因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃肠胀气因子、抗维生素因子、抗原蛋白等，这些抗营养因子阻碍营养物质在动物体内的利用，尤其是胰蛋白酶抑制因子的存在不仅会降低饲料营养成分的消化率和适口性，而且也会影响动物对蛋白质的消化吸收，对动物生长发育也产生不良的影响。
但是，胰蛋白酶抑制因子的测定较困难，而豆粕中脲酶活性与胰蛋白酶抑制因子活性呈正相关，所以通常通过测定脲酶活性来反映蛋白酶抑制因子的活性。
目前，脲酶活性的测定方法有滴定法（国标法）、pH增值法等，目前，对脲酶活性不同测定方法差异性的研究较少，本文拟对两种方法进行研究，以比较不同方法对测定结果的影响，为实际生产和理论研究提供依据和参考。
1 材料和方法1.1 实验材料大豆粉：将生大豆粉碎，过60目标准筛。
在85℃和140℃下分别处理0、45、90、135和180min冷却后装入封口袋保存备用。
1.2 化学试剂本实验所用试剂均为分析纯（AR），实验用水为蒸馏水。
1.3 测定方法1.3.1 pH增值法实验原理：将研细的试样与尿素缓冲液混合，尿素在尿素酶作用下水解产生氨，使溶液pH 值改变，改变的程度与脲酶活性大小相关，因此可以用其与空白溶液的差值表示脲酶活性高低，单位为△pH值。
随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。
判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。
脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。
脲酶活性没有负值，最低为0。
在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。
国内很多大企业一般均采用0.2。
实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。
目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。
一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。
2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。
3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。
颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。
样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。
第十届大学生创新大赛竞赛作品作品名称：饲用大豆及其制品中豚酶活性快速检测管学院：生物工程学院申报者姓名（集体名称）___________类别：□自然科学类学术论文□哲学社会科学类社会调查报告和学术论文□科技制作（投入较大的）V小发明创造饲用大豆及其制品中腮酶活性快速检测管研究报告摘要：饲用大豆及其制品中含有胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子，动物采食后会出现腹泻、胰腺肿大等症状，导致生产性能下降。
胰蛋白酶抑制剂的活性不易测定，但是由于蛋白酶抑制剂是一种蛋白质，对热的敏感性与腺酶相似，且两者共存，因此，本设计通过测定饲用大豆及其制品中麻酶活性来间接反映胰蛋白酶抑制剂的活性。
由于麻酶在室温下可将尿素水解生成氨，氨可使酚红指示剂变红且反应时间与腺酶活性具有相关性，因此将尿素缓冲液及酚红指示剂以一定的比例制备反应体系。
在比色管反应体系中直接加入待测饲用大豆及其制品，根据反应时间带入拟合方程，计算麻酶活性。
应用该检测管可以快速、准确、直观的检测饲用大豆及其制品中腺酶活性，进而对胰蛋白酶活性进行监测，从而判定饲用大豆及其制品的饲用安全性。
关键词：大豆豆粕服酶活性胰蛋白酶抑制剂快速检测管一、研究背景及意义饲料工业是现代畜牧业和水产养殖业发展的物质基础，直接关系到农业、农村经济发展和人民生活质量，已经成为国民经济的重要基础产业之一，在促进养殖业健康可持续发展、农民增收方面和改善人民的生活质量等方面发挥了重要的作用。
饲料安全问题日趋严重，有效解决饲料安全问题是保证饲料工业可持续发展的关键，也是保证动物源性食品安全的重要措施之一。
因此饲料安全检测变得尤为重要，饲料安全的快速检测技术，则为饲料安全的监督和检测提供重要的技术支撑。
随着饲料安全问题的相继曝光，由饲料安全问题引发的食品安全问题已经成为民众日常关心的热点和焦点。
为此，国家相关部门加大了饲料的监管、监测力度。
为了满足饲料安全监督的即时性需要, 迫切需要一些快速、方便、准确的检测技术，尤其是对某种或某类特别物质的快速检测，对提高饲料安全的监督和管理具有重要的作用。
大豆，及其制品是优良的植物性蛋白质饲料，同时含有丰富的矿物质与维生素，是目前世界范围内动物饲料原料中最常用的植物性蛋白饲料。
但是，大豆中也含有影响动物对饲料中营养物质的消化、吸收和利用的抗营养因子和一些有毒物质，如麻酶、胰蛋白酶抑制剂、植物性红细胞凝集素、皂昔等。
当抗营养因子的含量超过动物的耐受范围时会影响到动物的健康和生产性能。
大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制剂是影响动物安全食用的重要指标之一，由于其和腺酶都属于水溶性蛋白质，加热处理时都会失去活性，而且失活的速率大致相同，因此他们的活性指标与水溶性蛋白含量指标(即水溶性氮指数)存在着内在联系。
麻酶活性的大小可以定量的反映大豆及其制品在加热时的失活程度，通过测定腺酶活性可以间接预测大豆胰蛋白酶活性，因此快速、准确检测腺酶活性对监测饲用大豆及其制品的食用安全性具有重要意义。
在目前国际上测定腺酶活性的的方法大致有滴定法即国家标准方法(GB/T 8622-2006). pH增值法、酚红法等方法。
但是由于滴定法要求精度高，所用试剂品种较多，且配置复杂，测定过程中操作时间过长，操作步骤较严格，给检测人员的批次检测带来不便，难以在生产中快速应用。
实际生产中一般多用pH增值法，pH增值法由于测定结果的准确度与与精准度都不是很高，所以不具有仲裁性。
本次设计拟对酚红法、国标法两种方法进行研究，设计出一款兼顾时效性和准确性，满足现场要求，设计出大豆及其制品中腺酶活性快速检测管, 该管适应各种各样的需求环境，不需专业的实验室及专用的检测设备即可完成，实现快速、简便、准确的检测大豆及其制品中淼酶活性。
二、技术路线本研究的设计思路：首先制备不同熟化程度的大豆粉，应用国家标准方法对其进行腺酶活性测定得出结果，同时应用快速检测方法测定反应时间，并与腺酶活性值进行相关性研究，建立拟合方程。
对未知样品通过测定反应时间，通过带入建立的拟合方程来计算豚酶活性值。
技术路线图见图lo图1.技术路线图三、实施方案1 •材料与方法1.1大豆粉样品制备取若干生大豆粉，将生大豆粉在120匸烘箱中烘焙，分不同时间取出，制备不同梯度酶活性的豆粉。
釆样：用取样铲在托盘上取不同时间段的豆粉，分别有20 min.30 m in、40 m in、50mim、60 min、70 min、80 m in、90 in in、100 m in、110 min. 12 Omin的样品，冷却后将样品放入封口袋，扎紧以防松散，并贴上标签标注放一旁备用。
1.2试剂与溶液本实验所用试剂均为分析纯（AR）、水为蒸馆水121尿素缓冲溶液（pH7.0±0.1）：准确称取8. 95g磷酸氢二钠，3.40g磷酸氢二钾，加蒸馆水溶解定容至1000ml,再将30g尿素溶解在此缓冲溶液中，贴上标签放置一旁备用，有效期一个月。
1.2.2 盐酸溶液（O.lmol/L）:移液枪调至& 4,准确移取8. 4ml浓盐酸于烧杯中，加蒸馆水稀释至1000ml,贴上标签备用。
1.2.3氢氧化钠标准滴定液（O.lmol/L）：准确称取4g氢氧化钠溶于水，并稀释定容至1000ml,贴上标签（标签上应写标定后的实际浓度）备用。
1.2.4邻苯二甲酸氢钾(基准试剂):在100-125°C烘箱中干燥lh,置于干燥器中备用。
1.2.5提取液(尿素酚红溶液)的制备：称取一定量的邻甲苯酚駄，溶于乙醇(95%),用乙醇(95%)稀释至100ml备用。
称取一定量尿素(H2NC0NH2M99.0%)，溶于蒸馆水中并标定至500ml备用。
用胶头滴管吸取适量邻甲酚红溶液滴加至尿素溶液中。
在提取液中加入少量药品，将提取液配置在恒温箱中并且记录保存时间、备用。
(因提取液的配制过程中含有专利部分不便透露)1.3实验设备电热鼓风干燥箱、精准pH计、恒温水浴锅、精密计时器、分析天平、磁力搅拌器、移液枪等。
2.实验步骤2.1 电位滴定法：(GB/T 8622-2006)实验原理：将粉碎的大豆样品与中性尿素缓冲溶液混合，在(30 ±0.5)匸下保持30min,样品中的腺酶催化尿素产生氨，用过量的盐酸中和吸收氨，再用氢氧化钠溶液回滴到溶液的pH值为4. 70o准确称取0. 05g上述某一烘焙时间豆粉样品，称准至0. lmg,转入试管中，移入10汕尿素缓冲液，立即盖好试管并剧烈摇动马上置于30±0.即刻移入10mL盐酸溶液，迅速5°C恒温水浴中，准确计时保持30mino冷却到20°Co将试管内容物全部转入烧杯，用5niL水冲洗试管两次，立即用氢氧化钠标准溶液滴定到pH4. 70,并记录消耗氢氧化钠溶液的体积£。
另取试管做空白试验，加入10mL尿素缓冲溶液，10mL盐酸溶液。
称取与上述完全相同的试样，也称准至0. lmg迅速加入试管中。
立即盖好试管并剧烈摇动，将试管置于30±0.5°C恒温水浴中，同样准确保持20 min,冷却至20°C,将试管内容物全部转入烧杯，用5mL水冲洗试管两次，并用氢氧化钠标准溶液滴定至pH4. 70,记录消耗氢氧化钠的体积％多次平行试验，以减少实验误差。
量来表示尿素酶的活性（UA）,以每分钟每克大豆制品释放氨的mg可按下式计算：-V＞）） /30 X mUA= （14XC（VC-氢氧化钠标准溶液浓度V。
-空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积V厂测定试样消耗氢氧化钠溶液体积m-试样质量（g）2.2酚红法：称取O.Olg、0.02g、0.03® 0. 05g （目的是找出最适样品的质量）试样于试管中，加入配好的尿素酚红提取液10 mL,摇动10s, 静置、观察溶液颜色，并记录开始变红的时间及变色完全的时间。
四、实验结果1.不同熟化程度的大豆粉样品制备通过采用不同烘焙时间，制备不同熟化程度的大豆粉，并采用国家标准方法测定麻酶活性，以每分钟每克大豆制品释放氨的毫克量来表示尿素酶的活性（UA）,实验结果见表1。
表1不同熟化程度的大豆粉腺酶活性2.不同质量对快速检测时间的影响对制备后的不同熟化大豆粉采用本设计方法进行快速检测，根据反应时间及已经测得的魔酶活性进行相关性研究，建立不同质量条件下大豆粉豚酶活性与反应时间的拟合方程。
图2-5是不同质量大豆粉的快速反应时间与月尿酶活性关系图。
图表标题•■••••■•■••■■y = -1571ln('xr+^-33.MR2 = 0.936420 60 8040反应时间•系列1―"对数（系列1）4.543.5 3 甜2.5 I 21.510.50 0图表标题•系列1，—对数（系列1）图3： 0.02 g 大豆粉的腺酶活性与反应时间关系图表标题•■■ ■ ••- ・宀■•-・f ・・U- 1 2*1JL 6*T739』Rz=0.7441•系列1……对数係列1）10 20 30 40 50 S0反应时间4.5 4 3.5 封3I- 1.5 1 0.50 4.5 4 3.5 3 功2.5 vtn i 2 1.5 1 0.5 0图5： 0.05g 大豆粉的腺酶活性与反应时间关系从图2-图5可以看出，分别是O.Olg 、0.02g 、0.03g 、0. 05g 样 品，不同烘焙时间的豆粉对时间的影响，从拟合方程来看，它们都呈 对数相关，图2的相关系数F 相对来说还可以，误差不是很大，可以 作为参考数据的一部分；图3的相关系数F 最髙，误差最小，已经达 到了本次作品的要求；图4与图5的相关系数F 相对来说就太低，存 在的误差很大，不足以作为参考的对象。
不同时间、不同的称量质量 的反应时间各不相同，但是通过图2-图5可以很清楚的看出，除了 0. 02g 样品的变色时间比较为稳定，拟合方程的准确度高，其他三个 称量质量的样品都存在一定问题，经过分析，主要是一个原因，那就 是样品的质量（酶的数量）与底物的质量没有调节好，从表可以看出, 0.01 g 样品中出现底物不足，0. 03g. 0. 05 g 样品底物存在过剩，以 至于反应时间太长。
所以在本设计中釆用的最适样品质量为0.02 go 3.同一质量大豆粉检测快速反应时间与腺酶活性关系研究4.5图表标题•系列1……对数（粟列根据上述研究结果，将待测大豆粉的检测质量设为0. 02 g,测 定在该质量条件下不同麻酶活性与快速反应检测的时间关系，并建立 拟合方程。
结果见图6。
图6. 0.02 g 大豆粉的酶活性(UA)对反应时间⑸的关系从图6可以看出，应该本设计的快速检测方法测定相同质量 (0. 02小大豆粉在不同熟化程度的样品变色时间与酶活性具有很强的 相关性,Y=l ・ 5835(x)+7.4486,相关系数R=0. 9585o 应用该方程可 以对大豆粉的腺酶活性进行预测。
