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K m值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。
测定K m在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑整理用等研究中均具有重要的意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。
反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示，即米氏方程式：对于K m值的测定，我们通常采用Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。
具体做法为：取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图，即可得下图中的曲线，通过计算横轴截距的负倒数，就可以很方便地求得K m值。
本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。
在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。
通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度（单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比）。
具体反应如下：（1）酶促反应（2）呈色反应[二]实验试剂1.0.05mol/L尿素溶液2.0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液3.10%ZnSO4溶液4.0.5mol/LNaOH溶液5.10%酒石酸钾钠溶液6.钠氏试剂将碘化钾75g，碘55g，蒸馏水50mL以及汞75g，置于500mL锥形瓶内，用力振荡约15min，待碘色消失时，溶液即1.饱和K2CO3溶液：取112gK2CO3，加100mL水溶解2.标准盐酸溶液0.00100mol/L，0.00200mol/L，0.00300mol/L 用前标定3.凡士林4.硼酸指示剂混合液称取1g硼酸用水溶解，稀释至98mL，再加入2mL混合指示剂（将33mg溴甲酚绿及66mg甲基红一起溶于乙醇），稀释至100mL。
，用稀氢氧化钠溶液调至紫红色。
(三)操作方法康维皿是由玻璃、瓷或石蜡制成的浅皿，如右图所示，分内外两室，外室比内室高，边缘必须齐平，盖上玻璃片后与外室边缘不得有缝隙或缺刻。
综合研究性实验五：脲酶的制备及其生物学性质的研究一.实验目的1.学习大豆脲酶的提取方法；2.掌握脲酶米氏常数Km的测定方法；3.掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的方法；4.测定脲酶的活力单位及此活力；5.测定温度、PH、抑制剂对酶活性的影响。
二.脲酶提取液的制备脲酶提取液的制备方法方法锥形瓶内加入大豆粉2g和30%的乙醇20mL30min充分摇匀，放置于冰箱次日离心15min（3000rpm），取上清液即为脲酶提取液说明大豆粉中含脲酶不均一，酶浓度需作预实验稀释或酌情加量，原则上要求尿素浓度最大的一管的光吸收值在0.5-0.7为宜。
另外，脲酶需新鲜配制，本实验脲酶提取液的制备最好在0-5℃下进行，在室温下放置不应超过12h，在冰箱内放置不应超过24h，否则会影响实验结果。
三.脲酶Km的测定[一]实验原理K m值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。
测定K m在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等研究中均具有重要的意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。
反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示，即米氏方程式：对于K m值的测定，我们通常采用Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。
具体做法为：取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图，即可得下图中的曲线，通过计算横轴截距的负倒数，就可以很方便地求得K m值。
本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。
在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。
通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度（单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比）。
具体反应如下：（1）酶促反应（2）呈色反应[二]实验试剂1.0.05mol/L尿素溶液2.0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液3.10%ZnSO4溶液4.0.5mol/LNaOH溶液5.10%酒石酸钾钠溶液6.钠氏试剂将碘化钾75g，碘55g，蒸馏水50mL以及汞75g，置于500mL锥形瓶内，用力振荡约15min，待碘色消失时，溶液即发生高热。
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告本研究报告主要介绍从三个不同品种的刀豆当中提取脲酶的工艺流程并且确立了酶活性的检测方法。
通过固体浸提、乙醇分级沉淀、G-200葡聚糖凝胶过滤、冷冻干燥等工艺处理，最终获得比活性分别为923.6U/g，780.1U/g，585.3U/g 的脲酶。
1刀豆脲酶的提取工艺1.1 30%乙醇提取刀豆脲酶用天平称取干燥的刀豆，粉碎，以100目钢筛筛出豆粉。
向锥形瓶中加入10.0g豆粉，再加入100ml（固液比1：10）的30%乙醇溶液，充分摇匀30min，放置冰箱保存24h后，以4000r/min离心15min，上清液为脲酶粗提取液。
1.2 刀豆脲酶的分离纯化1.2.1乙醇分级沉淀向粗酶液中加入预冷（-20℃）的无水乙醇至终体积分数为10%，以8000r/min 冷冻离心10min进行一级沉淀，收集上清液；再向上清液中加入预冷无水乙醇至终体积分数为40%，以15000r/min冷冻离心10min，弃去上清液，收集沉淀，立即将沉淀溶于少量磷酸缓冲液（pH6.8）中，4℃保存备用。
1.2.2凝胶过滤脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G－200 层析柱，酶本身不能进入凝胶颗粒，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。
用磷酸缓冲液（pH=6.8）作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。
首先进行凝胶溶胀，然后装柱，加样，控制流速，流出的液体分别收集在刻度离心管中，收集量为 3 mL/管。
或者在设备允许的情况下，直接使用蛋白质自动纯化系统进行蛋白质纯化，本实验采用此种方法。
通过凝胶过滤，收集蛋白质含量较高的各管并4℃保藏备用。
1.2.3冷冻干燥将经凝胶过滤后的酶液分装在能够保证蒸发表面尽量大且厚度尽量薄的容器中，装量要均匀，然后进行冷冻处理，冻结之后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥。
干燥完毕后立即对样品进行酶活性检测，同时将产品低温保藏。
黄豆豆渣中脲酶的提取精制及其影响因素研究张铁军;施圆圆;孔令漪;曹蓝霄;周嘉青【摘要】为拓展脲酶的国产化途径,对黄豆豆渣中脲酶的提取进行了研究.建立了从黄豆豆渣中提取脲酶的全套流程,利用盐析法和有机溶剂沉淀法,通过浸提及离心等试验操作手段,将黄豆豆渣中的脲酶进行提取精制,产率为0.1％.同时确定了脲酶的最佳提取条件:其最佳浸提温度为50℃,最佳丙酮浓度为50％,最适pH为7.0.利用纳氏试剂比色法的原理,测得该脲酶在最佳实验条件下的米氏常数Km值为4.11×10-2 mol/L,1 mL脲酶溶液中的酶活力为18.63 U.从黄豆豆渣中提取脲酶,既可解决脲酶的国产化问题,又可提高黄豆豆渣的附加值,研究结果具有良好的工业价值和经济效益.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2017(007)003【总页数】5页(P253-257)【关键词】黄豆豆渣;脲酶;酶活力;Km;酶活影响因素【作者】张铁军;施圆圆;孔令漪;曹蓝霄;周嘉青【作者单位】广州医科大学生命科学学院,广州511436;广州医科大学生命科学学院,广州511436;广州医科大学第三临床学院,广州511436;广州医科大学第三临床学院,广州511436;广州医科大学南山学院,广州511436【正文语种】中文脲酶(urease)亦称尿素酶，是一种寡聚酶，分子量约为293 500 Da，等电点为3.9，具有绝对专一性[1]，特异性地催化尿素水解释放出氨和二氧化碳[2]。
脲酶是一种在各行业应用广泛的重要生物制剂。
广泛分布于豆类植物中，尤其是在黄豆、刀豆中含量丰富，约1%～1.5%。
在医药方面，脲酶是幽门螺旋菌感染诊断试验RUT中的一种重要的酶[3]；在农业方面，适当条件下应用种子封装与脲酶可显著增强植物早期阶段氮营养的吸收利用[4]，另外，脲酶还可用于尿素废水的处理[5]。
国外对脲酶的制备研究早已成熟，生产方法主要是从洋刀豆中提取脲酶，并于近年来开始致力于研究脲酶的其他作用，如利用重组酸性脲酶消除致癌因素氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)前体物质尿素等[6]。
大豆脲酶提取介绍大豆脲酶是一种重要的酶类物质，具有广泛的应用价值。
本文将深入探讨大豆脲酶的提取方法、应用领域以及未来的发展前景。
提取方法大豆脲酶的提取方法多种多样，下面将介绍几种常用的方法：1. 酸提法酸提法是利用酸性条件下脲酶的性质，将其从大豆中提取出来。
具体步骤如下： 1. 将大豆粉末与酸性溶液混合搅拌。
2. 调节pH值，使其处于脲酶最稳定的范围内。
3. 进行离心分离，将脲酶从溶液中分离出来。
4. 经过浓缩、纯化等步骤，得到纯度较高的大豆脲酶。
2. 酶解法酶解法是利用其他酶类物质，将大豆中的脲酶释放出来。
具体步骤如下： 1. 将大豆粉末与酶解剂混合，进行酶解反应。
2. 控制酶解反应的时间和温度，使脲酶能够完全释放出来。
3. 进行离心分离，将脲酶从溶液中分离出来。
4. 经过浓缩、纯化等步骤，得到纯度较高的大豆脲酶。
3. 超声波法超声波法是利用超声波的作用，破坏大豆细胞结构，释放脲酶。
具体步骤如下： 1. 将大豆粉末与溶液混合，置于超声波设备中。
2. 开启超声波设备，进行超声波处理。
3. 控制超声波的频率和功率，使脲酶能够充分释放出来。
4. 进行离心分离，将脲酶从溶液中分离出来。
5. 经过浓缩、纯化等步骤，得到纯度较高的大豆脲酶。
应用领域大豆脲酶具有广泛的应用领域，下面将介绍几个主要的应用领域：1. 洗涤剂大豆脲酶在洗涤剂中的应用得到了广泛的认可。
它能够有效地分解血渍、蛋白质等污渍，提高洗涤剂的清洁效果。
2. 食品工业大豆脲酶在食品工业中的应用也非常重要。
它能够降解食品中的蛋白质、淀粉等物质，改善食品的口感和质地。
3. 医药领域大豆脲酶在医药领域中有着广泛的应用。
它可以用于药物的合成、酶替代治疗等方面，具有很大的潜力。
4. 环境保护大豆脲酶在环境保护中也发挥着重要的作用。
它可以用于水处理、废物处理等方面，具有很好的净化效果。
发展前景大豆脲酶作为一种重要的酶类物质，具有广阔的发展前景。
脲酶提取工艺及活性检测方法研究报告本研究报告主要介绍从三个不同品种的刀豆当中提取脲酶的工艺流程并且确立了酶活性的检测方法。
通过固体浸提、乙醇分级沉淀、G-200葡聚糖凝胶过滤、冷冻干燥等工艺处理，最终获得比活性分别为923.6U/g，780.1U/g，585.3U/g 的脲酶。
1刀豆脲酶的提取工艺1.1 30%乙醇提取刀豆脲酶用天平称取干燥的刀豆，粉碎，以100目钢筛筛出豆粉。
向锥形瓶中加入10.0g豆粉，再加入100ml（固液比1：10）的30%乙醇溶液，充分摇匀30min，放置冰箱保存24h后，以4000r/min离心15min，上清液为脲酶粗提取液。
1.2 刀豆脲酶的分离纯化1.2.1乙醇分级沉淀向粗酶液中加入预冷（-20℃）的无水乙醇至终体积分数为10%，以8000r/min 冷冻离心10min进行一级沉淀，收集上清液；再向上清液中加入预冷无水乙醇至终体积分数为40%，以15000r/min冷冻离心10min，弃去上清液，收集沉淀，立即将沉淀溶于少量磷酸缓冲液（pH6.8）中，4℃保存备用。
1.2.2凝胶过滤脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G－200 层析柱，酶本身不能进入凝胶颗粒，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。
用磷酸缓冲液（pH=6.8）作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。
首先进行凝胶溶胀，然后装柱，加样，控制流速，流出的液体分别收集在刻度离心管中，收集量为 3 mL/管。
或者在设备允许的情况下，直接使用蛋白质自动纯化系统进行蛋白质纯化，本实验采用此种方法。
通过凝胶过滤，收集蛋白质含量较高的各管并4℃保藏备用。
1.2.3冷冻干燥将经凝胶过滤后的酶液分装在能够保证蒸发表面尽量大且厚度尽量薄的容器中，装量要均匀，然后进行冷冻处理，冻结之后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥。
干燥完毕后立即对样品进行酶活性检测，同时将产品低温保藏。
大豆脲酶的提取及其影响因素研究
周东凯;刘莹;马学良;刘冬梅;王占勇;马娟
【期刊名称】《大豆科学》
【年(卷),期】2008(27)4
【摘要】为了寻求大豆脲酶的国产化途径,对市售大豆进行了脲酶提取研究。
用乙醇水溶液从市售大豆中提取出了大豆脲酶,测得该脲酶的Km值为3.576×10-
2,1.0mL提取液的酶活力为26.58U。
大豆脲酶分解尿素的产物为铵氮,借助钠氏试剂比色法和凯氏定氮法对生成的铵氮进行了比色分析,进而从乙醇浓度、固液比、pH值考察了脲酶的最佳提取条件。
确定的最佳乙醇浓度为30%、固液比为1∶10,最适pH值为7.0。
【总页数】4页(P704-707)
【关键词】大豆;脲酶;Km;酶活
【作者】周东凯;刘莹;马学良;刘冬梅;王占勇;马娟
【作者单位】辽宁石油化工大学
【正文语种】中文
【中图分类】Q550.3
【相关文献】
1.黄豆豆渣中脲酶的提取精制及其影响因素研究 [J], 张铁军;施圆圆;孔令漪;曹蓝霄;周嘉青
2.单一和复合菌对大豆外观特性及脲酶活性的影响研究 [J], 谢益根;练小华;罗垂杨;
何余湧
3.大豆种皮中脲酶提取的研究进展 [J], 冯丽娟;符浩东;窦润雪;孙炜;李磊
4.大豆油体的提取及影响因素研究进展 [J], 田其英;王静
5.大豆脲酶诱导碳酸钙沉淀的多因素影响分析 [J], 原华;刘康;原耀楠;冯佳星因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
