小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立

小鼠骨髓细胞原代培养的步骤嘿，朋友们！今天咱来唠唠小鼠骨髓细胞原代培养这档子事儿。

你可别小瞧这小小的骨髓细胞，这里头的门道可不少哩！首先呢，你得准备好一只健康的小鼠。

就像厨师要准备新鲜的食材一样，这小鼠可得精挑细选。

把小鼠麻醉了，然后小心翼翼地把它固定好，可别让它乱动。

接下来，就是关键的一步啦！找到小鼠的骨头，用手术器械精准地把骨头取出来。

这就好比是在挖掘宝藏，得小心谨慎，不能有一点儿马虎。

把骨头弄干净后，用合适的工具把骨头敲碎，就像敲碎一块硬糖一样。

然后呢，把敲碎的骨头放到培养液里。

这培养液就像是细胞的小窝，得让它们舒舒服服地待在里面。

这时候，就需要你耐心地等待啦，就像等待花儿开放一样。

在等待的过程中，你可得时刻关注着，看看细胞们是不是在乖乖地生长。

这可不像种花儿，能直接看到它们长大，得用一些特别的方法去观察。

等细胞们长到一定程度，就得给它们换个更宽敞的地方啦，也就是传代培养。

这就好比是给孩子们换个更大的房间，让他们能更好地成长。

你想想看，这小小的骨髓细胞，从一只小鼠的身体里出来，经过我们的精心培养，就能变成好多好多的细胞。

这多神奇呀！就像魔术师一样，能把一样东西变成好多好多。

培养骨髓细胞可不是一件容易的事儿，需要我们细心、耐心，还得有技巧。

就像骑自行车一样，一开始可能会摔倒，但只要坚持，就能骑得稳稳当当。

在这个过程中，要是有一个步骤没做好，那可能就前功尽弃啦。

所以呀，每一步都得认真对待，不能有丝毫的马虎。

总之呢，小鼠骨髓细胞原代培养可真是个有趣又有挑战性的事儿。

要是你也感兴趣，那就赶紧试试吧，说不定你也能成为这方面的专家呢！。

原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞（primary astrocytes）是从胶质细胞含量较高的组织（如大脑皮层）中分离得到的。

其细胞培养方法如下：
1. 将新鲜脑组织剖出，用积聚素/液体软膜法（trypsin/liquid membrane method）进行酶解，使得细胞可以分离开来。

2. 使用无菌生理盐水或DMEM/F12将细胞悬液进行洗涤，然后放置在含有足够营养物质的培养基中，如DMEM。

3. 放置的培养皿需放置在37摄氏度、5% CO2和95%空气的恒温箱内，以提供最适宜的环境和养分。

4. 在培养初期，需要添加适当比例的血清（如胎牛血清），以提供必要的生长因子以及细胞所需的其它营养物质。

但在细胞数目增长到一定规模后，可将血清浓度逐步降低，以避免胎牛血清对实验结果的影响。

5. 定期更换培养基，以保证细胞在最佳的生长状态。

6. 如需进行实验或操作，需要将细胞从培养皿中移入滴定皿或其它相应容器中，并按照操作所需加入相应的药物或物质。

注意事项：
1. 在操作过程中需要尽可能避免对细胞的机械损伤，比如抽吸和强烈摇动。

2. 在移入滴定皿或其它操作容器时，需要注意细胞的密度，以避免过于稀疏或过于密集。

3. 在更换培养基、加药等操作时，需要十分温和，以避免对细胞造成伤害或死亡。

星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养
1、取新生24h内的C57BL/6J乳鼠，在超净工作台中用75％乙醇浸泡3～5min消毒，断头，无菌条件下用眼科剪小心剪开头骨，取两侧大脑，体视镜下剥除脑膜，取出大脑皮质置于盛有HBSS液的无菌培养皿内。

2、用预冷的HBSS液漂洗2次，剪碎大脑皮质制成糜状，以0.25％的胰酶液，1:4与不完全培养基混合，37℃消化15min，并用含有10％胎牛血清的DMEM/F12-K完全培养基终止消化，轻轻吹打。

3、800g离心5min，弃上清。

4、用DMEM／F12完全培养基制成单细胞悬液，以70目滤网过滤，吸取细胞悬液接种至预先已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中培养。

0.5h后将培养基移至已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内继续培养。

5、24h后轻柔换液。

以后每隔2～3d换一次培养液，且每次换液前用HBSS 液剧烈振荡洗涤2次，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。

6、7至8天后，当星形胶质细胞汇合并且覆盖的小胶质细胞暴露在星形胶质细胞层上或已经与星形胶质细胞层分离时，在轨道摇床上以180rpm摇动T25烧瓶120分钟以分离收集小胶质细胞。

加入新鲜的细胞培养基，并在240rpm下16小时继续摇动烧瓶以除去少突胶质细胞前体细胞（OPC）。

7、胰酶消化后的细胞移至培养皿中传代，培养2d后可用免疫荧光的方法进行细胞鉴定。

小鼠细胞试验培养步骤小鼠细胞常用的分别方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分别和培养原代细胞。

一、试验分别和培养步骤1. 小鼠颈椎脱臼处以死刑后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。

2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。

3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后赶忙转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。

4. 清洗完成后，用剪刀镊子搭配除掉自动脉弓和心房组织，仅保管心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。

5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。

A. 贴块法6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3—5 min。

7. 消化完成后，添加数毫升FBS停止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T—25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2—4h。

8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触全部的组织块。

9. 之后放入培养箱中连续培养，一般2—4天后成纤维细胞会从组织块四周爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。

B. 消化法6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。

7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS停止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3—5次，直至组织块消化。

胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养1）于细胞培养前1d，用0.05% PLL(or PLO)包被培养瓶，置5% CO2培养箱中6 h以上，使用前用HBSS液冲洗3次，备用；2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中；3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm 小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0. 25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7 min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀；4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化；5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多；6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次；7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块；8）1000 r/min×5min，弃上清；9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL；10）接种24 h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片；11）细胞每3 d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。

分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5 h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。

星形胶质细胞和小胶质细胞培养文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养培养箱中6h以上，使用1）于细胞培养前1d，用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶，置5%CO2前用HBSS液冲洗3次，备用；2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中；3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0.25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀；4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化；5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多；6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次；7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块；8）1000r/min×5min，弃上清；9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL；10）接种24h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片；11）细胞每3d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。

分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。

星形胶质细胞的培养星形胶质细胞，是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。

用经典的金属浸镀技术（银染色）显示此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用。

细胞突起的末端常膨大形成脚板或称终足，有些脚板贴附在邻近的毛细血管壁上，因此这些脚板又被称为血管足或血管周足，靠近脑脊髓表面的脚板则附着在软膜内表面，彼此连接构成胶质界膜。

那么星形胶质细胞如何进行培养呢，下面介绍下此细胞的培养方法。

一、实验器械和试剂器械有剪刀、小镊子、小毛刷等，试剂DMEM/F12培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿等。

二、星形胶质细胞的混合培养取新生SD小鼠若干只（出生24h），在无菌条件下断头，迅速剪开颅骨，取出脑组织与预冷的PBS液中反复冲洗以去除血污，再移入另一盛有PBS的培养皿中，用小毛笔轻轻刷去脑组织表面的脑膜和血管，用PBS冲洗后剪去脑干仅保留大脑半球，用小剪刀充分剪碎脑组织，加入比组织块总量多30-50倍的0.05%胰蛋白酶，再移入50ml的离心管中，用吸管反复吹打消化至无明显的脑组织块为止，然后加入DMEM/F12完全培养基（含10%的胎牛血清、100U/ml青-链霉素）终止消化，反复吹打制成单细胞悬液，1000r/min离心5min，弃去上清液，加入一定量的完全培养吹打成单细胞悬液，接种到培养瓶中，置于细胞培养箱中培养，3-4h后更换一次培养液，以后每3天换夜一次，注意观察细胞的生长情况。

三、星形胶质细胞的分离和纯化将培养于培养瓶中的混合胶质细胞培养液弃去，用PBS清洗2遍，加入0.25%的胰酶于培养箱中消化，在镜下观察至细胞脱落，然后加入完全培养基终止消化，1000r/min离心5min，将细胞沉淀重悬接种于培养瓶中，置于培养箱中培养，稳定1天后，再恒温摇床200r/min振摇2h，吸取上清液（去除一些小胶质细胞和部分少突胶质细胞），贴壁细胞用0.25%的胰酶消化，方法同上，然后用完全培养基重悬接种到培养瓶中，稳定1天后用于后续实验。

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞（astrocytes）是中枢神经系统中一种重要的胶质细胞，主要起支持和维护神经元生存、供能以及调节神经元活动等功能。

原代培养和分离纯化小鼠星形胶质细胞是研究其生物学特性和相关疾病发生机制的重要实验方法。

以下是一种常用的小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案。

实验材料和仪器：1.小鼠（新生仔小鼠）2.离心管、培养皿、显微镜3.无菌生理盐水、套管、吸头4. DMEM/F12培养基、FBS、胰蛋白酶、DNase I5.离心机、试管摇床、显微镜、离心管架6.显微针、细胞计数板、加热振荡器实验步骤：1.小鼠的准备：a.使用新生仔小鼠，从母鼠的子宫中取出。

b.将小鼠头部朝下放在无菌生理盐水中，用套管轻轻吸出小鼠颅内的脑组织。

c.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的离心管中，并用离心管摇床低速振荡15-20分钟使细胞均匀分散。

2.细胞分离：a.将离心管架放在显微镜下，用显微针将脑组织均匀挫碎。

b.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的培养皿中。

c. 添加0.25%胰蛋白酶和10 U/ml DNase I，37°C孵育30分钟。

d.轻轻吸入含有酶切的脑组织，并用吸头轻轻洗涤脑组织，收集上清液。

e.将上清液通过0.22μm的滤网过滤，除去大颗粒的细胞。

3.细胞培养：a. 将滤过后的细胞悬液计数，计算细胞密度并将其稀释至10^6细胞/ml。

b.取DMEM/F12培养基，添加10%FBS，将稀释后的细胞悬液转移到培养皿中。

c.在培养皿中加入5%CO2，37°C孵育。

d.每两天更换一次培养基，直到细胞至80%～90%的密度。

4.纯化小鼠星形胶质细胞：a.将培养皿中的细胞收集到离心管中，进行离心。

b.用无菌生理盐水洗涤细胞，去除不附着的细胞和残留的培养基。

c.将洗涤后的细胞用DMEM/F12培养基重新悬浮，计数并计算细胞密度。

d.用磁层细胞分选仪，通过细胞表面标记的抗体对细胞进行阳性选择，分离纯化小鼠星形胶质细胞。

小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。

今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。

看来做小鼠MSC的战友越来越多。

一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。

其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。

欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。

提纲一，简版主要步骤及操作要点。

二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。

我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。

……呵呵，跑题了。

小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外原代培养方法的建立及鉴定姚云;戈果【期刊名称】《饮食科学》【年(卷),期】2018(0)9X【摘要】目的:建立小鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外原代培养方法,为进一步研究星形胶质细胞奠定基础。

方法:取新生24h内ICR小鼠大脑皮质进行体外原代培养,采用免疫细胞化学法检测星形胶质细胞特异性标记蛋白—胶质纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定原代培养的星形胶质细胞。

结果:原代培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态且生长良好,原代培养至第14天以后星形胶质细胞纯度达95%以上。

结论:本研究建立的星形胶质细胞体外原代培养方法能获得较高纯度的星形胶质细胞,且操作简单、可靠。

【总页数】2页(P257-258)【关键词】ICR小鼠;星形胶质细胞;原代培养;鉴定【作者】姚云;戈果【作者单位】毕节医学高等专科学校人体解剖学教研室,毕节贵州551700;贵州医科大学人体解剖学教研室,贵阳贵州550025【正文语种】中文【中图分类】R-33;Q813.1【相关文献】1.小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立 [J], 黄艳丽;李春岩;许蕾;段伟松;蒋怡芳;姜虹;郭艳苏;范志亮;张瑞燕;任文博2.新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及鉴定 [J], 罗湘颖;陈成;邓永文;陈风华;黄永凯;方芳;高俊玮;柳浩然;毕长龙;曾飞跃;周仁辉;芦明3.新生小鼠大脑皮质神经细胞体外培养方法及鉴定 [J], 娄磊;胡晓;朱加应;万兴;王建怡4.新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及鉴定 [J], 罗湘颖;杨志敏;王廷华;刘苏;赵匡彦5.新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定 [J], 梅莉;路浩;刘宗平;何玉琴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

小鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法的比较【关键词】星形胶质细胞;,离体培养;,反应性星形胶质细胞;bystin［摘要］目的: 比较离体纯化和培养星形胶质细胞的不同方法，旨在获得高纯度的星形胶质细胞，为进一步研究奠定基础。

方法: :用原代培养、传代纯化和一次或两次振荡纯化的方法培养星形胶质细胞。

结果: 原代培养的星形胶质细胞纯度不高;经传代纯化培养后纯度达到99%以上，bystin表达量较少，且能经短时间模拟缺血诱导活性明显增高;经振荡纯化后bystin表达量明显增多，GFAP免疫荧光变亮，能耐受长时间模拟缺血，提示经振荡后星形胶质细胞已经处于“活化”阶段。

结论: 经过传代Na3VO4， NaF是磷酸酶抑制剂，如果你作的蛋白是磷酸酶建议不要加。

Aprotinin, leupeptin, pepstatin是蛋白酶抑制剂比较昂贵，如果没条件，只加PMSF也可以，但必须严格操作，防止蛋白降解。

提取的蛋白放－70保存。

纯化的星形胶质细胞纯度最高，可以经模拟缺血诱导成反应性星形胶质细胞，因此能更好地反映其在脑中的功能，是研究星形胶质细胞在脑中的功能和反应性星形胶质细胞较好的培养方法。

［关键词］星形胶质细胞; 离体培养; 反应性星形胶质细胞;bystinT o establish a cultural method of astrocytes by comparison of different ways of isolation astrocytes from mouse cerebralDU Fang，WU Xiao-mei，ZHU Li（Institute of Nautical Medicine，Nantong University，Nantong Jiangsu 226001，China）［Abstract］Objective: Comparing different ways of isolation and purify astrocytes from mouse cerebral tissue to establish an optimal culture method of astrocytes for future study of their functions in the brain. Methods: To acquire purified astrocytes by four usually used cultural methods: primary culture，subculture for three times，shanken overnight once or twice. Results: The purity of primary culture was the lowest，with the method of being subcultured for three times the purest，appear>99% pure. The expression of bys- tin was low and cell ability could be enhanced by short-timed simulated ischemia with the subcultural meth-od. Astrocytes purified by being shanken overnight once or twice highly expressed bystin，immunocytochem-ical staining with anti-mouse GFAP was brighter and could endure simulated ischemia for longer time，which demonstrated that the astrocytes might have been activated by shaking. Conclusion: With the subcultural method we can acquire the purest astrocytes in vitro，which can be induced to reactive astrocytes by simula-ted ischemia，and can best reflect their functions in the brain. It′s an optimal method to acquire the astro-cytes for future study of their functions in vivo and reactive astrocytes.［Key words］astrocyte; in vitro; reactive astrocyte; bystin在中枢神经系统中，胶质细胞是主要的组成部分，其中星形胶质细胞在中枢神经系统中发挥着多种作用，组成血脑脊液屏障，营养和支持神经元，与神经元突触的发生有着密切联系［1］。

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞是中枢神经系统中的一类胶质细胞，具有重要的生理功能。

进行小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验是研究其功能和机制的关键步骤之一、下面是一份关于小鼠星形胶质细胞的原代培养及分离纯化实验方案。

实验步骤：1.小鼠主星形胶质细胞原代培养（1）准备培养基：将DMEM/F12培养基配制好，添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和20ng/mL生长因子（如EGF和bFGF），混匀即可。

将培养基过滤灭菌。

（2）小鼠灭菌和解剖：选取3-5天龄的小鼠，进行表面消毒处理，解剖小鼠颅脑组织。

（3）组织分离：将解剖得到的小鼠颅脑组织放入培养皿中，使用去髓针将组织剪碎，加入2mL预先配制好的DMEM/F12培养基。

（4）消化组织：使用0.25%胰酶溶液和0.05%胆汁酸溶液进行组织消化，将组织置于37°C的恒温槽中，用胶性吸管轻轻吹泡，约30分钟后停止消化。

（5）细胞分离：用离心机将细胞分离，将上清液收集到新的离心管中，用DMEM/F12培养基进行稀释后离心。

（6）细胞计数：用显微镜观察细胞形态，进行细胞计数。

（7）细胞培养：将细胞悬浮液转移到预先涂有胶原的培养皿中，加入预先配制好的培养基，放入培养箱中，37°C、5%CO2培养。

2.小鼠星形胶质细胞分离纯化（1）胶质细胞去除：在培养2-3周后，使用轻轻摇晃的方法将胶质细胞除去，以保留星形胶质细胞。

（2）非星形胶质细胞去除：使用超声波分离方法对星形胶质细胞进行提纯，将细胞悬浮液转移到离心管中，使用超声波技术使星形胶质细胞聚集起来，再次离心。

（3）细胞计数和分装：用显微镜观察细胞形态，进行细胞计数并分装到新的培养皿中。

（4）鉴定纯化程度：使用免疫细胞化学方法，如免疫荧光染色，检测特定星形胶质细胞标志物的表达水平，以确定纯化程度。

（5）细胞培养：将纯化后的星形胶质细胞继续培养，并进一步进行功能和机制的研究。

万方数据１８４物中心提供；ＤＭＥＭ干粉购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；胰蛋白酶（Ｔｒｙｐ－ｓｉｎ）、青霉素一链霉素均为Ｓｉｇｍａ公司产品；Ｄ—Ｈａｎｋｇ液为实验室自配；ＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＧＦＡＰ单克隆抗体及ＣＹ５Ａｎｔｉ．Ｍｏｕｓｅ荧光二抗购自Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司；Ｈｏｅｃｈｓｔ为Ｓｉｇｍａ公司产品。

２．原代培养①取１—３ｄ的新生ＩＣＲ小鼠，将其断头处死，在无菌条件下由腹侧取出脊髓，置盛有Ｄ—Ｈａｎｋｇ液的小皿中，在解剖显微镜下剔除脊膜，随后换到另一干净的小皿中。

②在小皿内剪碎脊髓，大小为１×１×１，再将其移人尖底离心管中，加２～３倍体积的０．２５％胰蛋白酶，在３７℃下消化１５ｍｉｎ，加入等体积的含血清培养基（不含抗生素）终止消化；轻吹２０次左右，静置片刻，将上清吸人另一离心管中，原离心管中加入１ｍｌＤ—Ｈａｎｋｇ轻吹洗脊髓后将上清移入另一离心管中，在原离心管中加入ｌ～２ｍｌ的０．２５％胰蛋白酶再次消化１５ｍｉｎ，终止后连同上次消化的上清液一起１５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液，再加入含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，机械吹打使细胞分散，制成单细胞悬液。

③血细胞计数板计数后调整密度到ｌ×１０５接种于无底物黏附的２５ｃｍ２玻璃培养瓶，在３７℃，５％ＣＯ：培养箱中培养。

④每天倒置显微镜下对细胞进行观察，接种２４～４８ｈ后细胞第一次换液，以后每周换液两次。

３．星形胶质细胞的纯化细胞培养７～１０ｄ待细胞分层生长后，置于３７。

Ｃ摇床中２００ｒ／ｍｉｎ振荡６ｈ，弃含脱落细胞的细胞悬液，Ｄ－Ｈａｎｋｇ液洗３次，加入含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，放入３７℃，５％ＣＯ：培养箱中继续培养。

为提高星形胶质细胞的纯度，可在传代后约５—７ｄ细胞融合时，再次放人摇床中振荡，重复上述操作。

４．传代培养①取已培养１５ｄ左右的原代培养物，吸去旧培养基，用Ｄ—Ｈａｎｋ童液洗２次，然后滴加４００１ｚｌ０．１２５％胰酶一ＥＤＴＡ，倒置显微镜下观察，待细胞回缩，细胞间隙增加时用不含抗生素的培养基终止消化，并轻轻左右摇动培养瓶，随后用弯吸管轻轻吹打制成细胞悬液，分别接种于另两个２５ｃｍ２的培养瓶，在３７℃，５％Ｃ０２条件下培养。

治疗脊髓损伤之建立星形胶质细胞模型的研究进展杜凯然;郭挺;邓强;张彦军;朱宝;马同;彭冉东;李军杰;徐浩军;王雨榕【摘要】脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种极为复杂的破坏性疾病,一旦脊髓损伤发生,治疗棘手,对患者家庭、国家带来巨大的经济、社会负担.近年来,通过建立大鼠脊髓损伤细胞相关模型,对于脊髓损伤的病因病机治疗等方面有了进一步的认识,而星形胶质细胞模型的建立对脊髓损伤治疗有深远意义.研究发现,星形胶质细胞作为靶细胞通过血-脑脊液屏障直接或间接对脊髓损伤有双向调控作用.本文通过对近年来星形胶质细胞模型培养制备方案等研究进行总结,以期为建立一个客观化、定量化、可模拟化的星形胶质细胞模型提供指导对脊髓损伤的治疗提供新的思路.【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2019(027)004【总页数】5页(P540-544)【关键词】脊髓损伤;星形胶质细胞;细胞造模;血-脑脊液屏障;小胶质细胞【作者】杜凯然;郭挺;邓强;张彦军;朱宝;马同;彭冉东;李军杰;徐浩军;王雨榕【作者单位】甘肃中医药大学,中医临床学院,兰州 730000;甘肃省中医院,脊柱骨二科,兰州 730050;甘肃省中医院,脊柱骨二科,兰州 730050;甘肃省中医院,脊柱骨二科,兰州 730050;甘肃省中医院,脊柱骨二科,兰州 730050;甘肃中医药大学,中医临床学院,兰州 730000;甘肃省中医院,脊柱骨二科,兰州 730050;甘肃中医药大学,中医临床学院,兰州 730000;甘肃中医药大学,中医临床学院,兰州 730000;甘肃中医药大学,中医临床学院,兰州 730000【正文语种】中文脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是由各种原因引起的脊髓结构和功能损害，造成损伤水平以下脊髓神经功能(运动、感觉、括约肌和自主神经功能)障碍[1]。

SCI作为脊柱损伤最常见且最严重的并发症，呈逐年上升的趋势[2]。

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。

1. 实验材料与试剂剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F1培养液、胎牛血清、马血清、0.25%, 0.05%胰蛋白酶、PBS®、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL细胞培养瓶、CO恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue 染色液、抗小鼠0X4单克隆抗体和新生SD」、鼠等试剂配比：(1) DMEM 10:10:1DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)(2) DMEM 5:5:1DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S(3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS ( DMEM/F12 无血清培养基+生长因子)25卩g/m转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1卩g/ml putrescine (腐胺)，5 卩g/m胰岛素，20 nM hydrocortisone (氢化可的松)，20 nM progesterone (孕激素)，1 %P / S+生长因子(5ng/ ml的血小板衍生生长因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF )胰蛋白酶/ EDTA溶液0.05 %胰蛋白酶+0.02 % EDTA在W / O 内Ca2+ / Mg2 + 的HBSSDMEM/F12 con ta ining 25 卩g/ml tran sferri n, 10 nM biot in, 30 nM sodium selenite, 1 卩g/ml putrescine, 5 卩g/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nMprogesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF) Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+37oCmicrodissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forcepsTabletop centrifugeT75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal （BD Falcon, 137787）culture plates （Falcon）（Saatilene, Hitech）2. 实验步骤2.1 星形胶质细胞的混合培养取新生SD」、鼠若干只（出生24h内），在无菌条件下断头,迅速剪开颅骨,取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中，用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管,用PBSR冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用、剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块；加入DMEM/F12完全培养基（含10%S台牛血清、100U/mL青霉素和100 ug/mL 链霉素）终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min,弃上清；加定量完全培养液再次制成细胞悬液，更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中，置于5%COS温细胞培养箱（37度）培养； 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。