过氧化物酶活性的测定

一、实验目的了解过氧化物酶（POD）在植物生理学中的重要作用，掌握测定POD活性的方法，并分析不同因素对POD活性的影响。

二、实验原理过氧化物酶是一种广泛存在于植物组织中的酶，能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2）。

在实验中，通过测定在一定时间内POD分解H2O2产生氧气的量，来评价POD的活性。

反应方程式如下：2H2O2 → 2H2O + O2本实验采用愈创木酚法测定POD活性。

愈创木酚在POD催化下被氧化，生成对苯醌，进而与氯化铁形成紫色络合物，通过测定紫色络合物的吸光度变化来反映POD的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 植物叶片（如马铃薯、菠菜等）- 过氧化氢（H2O2）- 愈创木酚- 氯化铁- 磷酸氢二钠（Na2HPO4）- 磷酸氢钠（NaH2PO4）- pH计- 离心机- 分光光度计- 研钵- 试管- 移液器- 电子天平2. 实验试剂：- 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 M H2O2溶液- 0.5 M愈创木酚溶液- 0.1 M氯化铁溶液四、实验步骤1. 酶液提取：将植物叶片洗净、剪碎，加入预冷的磷酸盐缓冲液，在研钵中研磨成匀浆。

将匀浆液转移至离心管中，4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液即为酶液。

2. 测定酶活性：取5支试管，编号为1-5，分别加入以下试剂：- 空白组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL- 实验组：0.1 M磷酸盐缓冲液1.0 mL、0.1 M H2O2溶液1.0 mL、0.5 M愈创木酚溶液1.0 mL、酶液0.1 mL将各试管混匀，置于37℃恒温水浴中保温5分钟。

取出试管，立即放入冰浴中终止反应。

使用分光光度计在波长560 nm处测定各试管吸光度。

3. 计算酶活性：以空白组吸光度为基准，计算各实验组吸光度变化值（ΔA）。

根据下列公式计算酶活性：酶活性（U/g·min）= ΔA × 0.05 × 10^3 / 酶液浓度五、结果与分析1. 不同植物叶片POD活性比较：实验结果显示，不同植物叶片的POD活性存在差异。

过氧化物酶活性的测定实验报告实验名称：过氧化物酶活性的测定实验实验目的：1. 了解过氧化物酶（CAT）的性质及其在生物体内的作用；2. 学习如何测定CAT活性。

实验原理：CAT是一种重要的氧化酶，在生物体内主要负责清除细胞内的过氧化氢（H2O2）。

CAT能够将H2O2分解为水和氧，从而减少H2O2引起的细胞损伤。

因此，CAT的活性是衡量生物体抵抗氧化损伤能力的重要指标。

该实验通过比色法对CAT活性进行测定，其原理是：CAT能够快速分解H2O2，导致溶液中H2O2浓度的降低，从而使紫外吸收波长为240nm处的吸光度降低。

实验步骤：1.制备1mg/ml的CAT标准溶液；2.制备一定浓度的H2O2溶液；3.将CAT标准溶液和H2O2溶液分别稀释为不同浓度；4.将待测样品（如动物组织、血清等）加入混合液中，使得CAT参与H2O2的分解反应；5.反应10min后，加入硫酸铨（K2Cr2O7）溶液并混匀，其中硫酸铨是一种催化剂，能够加速反应速度；6.反应后，在240nm处测定溶液的吸光度；7.根据不同CAT标准溶液的吸光度值，绘制标准曲线；8.根据待测样品的吸光度值，利用标准曲线计算出CAT的活性。

实验结果：利用如上实验步骤，我们测得样品A的吸光度为0.56，样品B的吸光度为0.36，样品C的吸光度为0.22。

依据标准曲线的测定结果，我们可分别计算出样品A、B、C的CAT活性分别为12.3、8.4、5.2 U/g。

实验结论：本实验采用比色法测定了不同样品中CAT的活性。

结果表明，样品A的CAT活性最高，样品C的CAT活性最低。

通过该实验，我们可以了解CAT的性质及其在生物体内的作用，同时也掌握CAT活性的测定方法。

过氧化物酶活性测定
过氧化物酶（peroxidase）是一类广泛存在于各种生物中的酶。

它们能够催化过氧化物与底物之间的氧化还原反应。

此类酶有多种生物功能，其中最重要的是用于废弃物的代谢和细胞保护。

在工业和农业领域中，过氧化物酶也常被用作催化剂。

因此，对于过氧化物酶的活性测定十分重要。

传统的过氧化物酶活性测定方法主要包括光谱分析法、吸光度法、滴定法、电化学法等。

今天我们主要介绍光谱分析法的原理和步骤。

过氧化物酶在酸性pH下的催化活性主要是由其含有的含铁金属离子（Fe3+）决定的。

Fe3+构成的氧桥结构能够与底物发生氧化还原反应，同时产生吸收峰。

因此，利用曲线拟合的方法可以测定样品中过氧化物酶的活性。

具体操作步骤如下：
1. 处理样品。

将待测样品加入一定比例的磷酸盐缓冲液（pH 5.0）。

若含有颜色物质需添加过滤效果的吸附剂。

2. 加入反应液。

向样品中加入过氧化氢，使其浓度为0.1%。

3. 反应后读取吸收度。

反应结束后，利用紫外-可见光谱仪读取其吸收值。

4. 分析数据。

根据吸收峰的强度和波长，利用标准曲线计算出过氧化物酶的活性。

总之，过氧化物酶活性的测定对于研究生物学和工业化学等领域都具有重要的意义。

随着科学技术的不断发展，相信在未来，这一领域的研究也将不断深入，为我们带来更多的新发现和应用。

实验六：过氧化物酶活性的测定左哥一、实验目的：过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酶类物质代谢，植物抗性密切相关。

通过实验掌握提取POD和测定其活性方法和原理。

二、实验原理：过氧化物酶催化H2O2氧化酶类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其它分子缩合，产生颜色较深产物。

本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，次产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸收光度变化得知过氧化物酶的活性。

三、材料与试剂材料：马铃薯试剂：20m mol/L KH2PO4,反应混合液四、方法步骤：1、酶液制备：称取材料1.079g，加入20m mol/L KH2PO4 5ml,于研钵中研磨成匀浆，在3000r/min，下离心10min,上清液转入25ml,容量瓶，残渣再用5ml, KH2PO4,提取一次，定容，混匀，贮于冷凉处备用。

2、比色测定：光径1cm比色杯两只，1只先加1ml KH2PO4，再加3ml混合液作参比液；另一只加1ml,酶液，3ml混合液，立即计时并置于分光光度计中，在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测8min，每次测定前重新对照校准。

五、实验结果酶活力（0.01 A470/L）=(A2-A1)/0.01(t2-t1)*(V2/V1)=328.2μ酶的比活力（μ/g）=酶活力/样品重=304.2μ/g实验七：种子生活力快速测定一、实验目的：种子生活力即种子发芽潜力，是鉴定种子力量研究种子储藏生理的重要指标，本实验运用TTC，红墨水发快速测定种子生活力。

二、实验原理：1、TTC法：有生活力的种子呼吸作用产生的NADH能还原TTC，生产的红色的TPE，将胚染成红色，无生活力的种子，无呼吸代谢活动，不能还原TTC，肧不着色。

2、红墨水法：植物活细胞的原生质膜有选择透性，某些染料分子不能透过。

如红墨水，因而不能将种肧染色，而死的种肧，其细胞膜结果破坏，选择透性丧失，因而染料分子能透过膜进入细胞将种肧染色。

实验五_过氧化物酶酶活性的测定一、实验原理1. 过氧化物酶（POD）在植物生长过程中发挥重要作用。

在压力、紫外线辐射、微生物侵入和病原体感染等外界刺激下，植物组织中的过氧化物酶活性会显著增加，以保护植物免遭伤害。

2. 过氧化物酶是一种氧化酶，催化产生氧气的反应（如下）：ROOR′+ 酶———> R′OH + O23. 过氧化物酶活性的测定实验基于上述反应，利用巴尔的显色方法测定过氧化物酶催化下的氧化反应速率。

二、实验步骤1. 将100mL的3% H2O2（v/v）制成浓度为60mmol/L的过氧化氢溶液。

2. 按0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL 5个等份，取出浓度分别为6、12、18、24、30mmol/L的H2O2溶液，放入5个试管中。

4. 将1mL的20mg/mL酶溶液加入中等浓度（12mmol/L）的H2O2溶液中，混合均匀。

缓慢倾斜试管，使溶液彻底混合。

5. 取出一根手指，将其浸泡于硫酸铁铵溶液中。

将试管倾斜，瓶口与硫酸铁铵溶液接触，放入深100°C的水浴中加热2min。

将溶液混合均匀。

6. 将试管移出水浴，冷却到室温后，再加入1mL的硼酸缓冲液，混合均匀。

7. 测定吸收值（深紫色的铁化合物阴离子形成）。

利用光度计在546nm处测量。

8. 按照如上步骤分别测定不同浓度下的H2O2溶液。

三、结果分析1. 计算各试管中产生的氧气量，并绘制曲线（以5mmol/L，10mmol/L，15mmol/L，20mmol/L，25mmol/L的浓度为横坐标）。

2. 计算过氧化物酶活性（OD/min/mg）。

四、实验注意事项1. 检查瓶塞和试管，确保没有损坏。

2. 操作过程中，需严格按照试剂用量来添加试剂。

3. 热水浴器的温度应为100°C。

4. 硫酸铁铵溶液应略微加热一会儿，以充分溶解。

5. 实验过程中避免强光照射。

园艺学院设施201402李密实验三（一）过氧化物酶活性的测定（愈创木酚法）一、实验目的通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法和原理。

二、实验原理以愈创木酚为底物，在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。

此产物在470nm波长处有最大光吸收值，故可通过测470nm波长下的吸亮度变化测定过氧化物酶的活性。

三、材料、设备和原理1.材料马铃薯块茎2.设备光亮度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管3.试剂已配置好的反应混合液、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液四、操作方法1.酶液制备2．比色测定计算：酶活力（0.01A 470/min ）=A2−A1(t2−t1)×0.01×D=0.875−0.385(7−2)×0.01×25 =245.0酶的比活力（μ/g ）=酶活力（μ）样品重(g )或样品中蛋白质的含量（mg ）=245.00.9956=246.08 六、讨论1、由于仪器较少,等待测POD 值的时间较长,且没有放在低温下保持。

导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。

2、理论上POD 值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系。

可能原因有①把酶液加入到3ml 反应混合液时，反应太快，待到1min 读取POD 值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。

②离心出来的酶液在室温下放置时间过长。

（二）可溶性蛋白质含量的测定（考马斯蓝G -250法）一、实验目的掌握测量可溶性蛋白的方法及其原理。

二、实验原理可溶性蛋白质与考马斯蓝G -250反应生成青色产物，在595nm 波长有最大吸收峰，其颜色深浅与可溶性蛋白含量成正相关，可用分光亮度法测定可溶性蛋白的含量。

三、材料、设备和原理 1.材料马铃薯提取液2.设备分光亮度计、10ml 刻度试管、移液管3.试剂考马斯蓝G -250、100μg/ml 标准蛋白液 四、操作方法 1. 标准曲线制作2. 样品液测定试剂 0号 1号 2号 3号 4号 5号 标准蛋白体积/ml 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水体积/ml 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 考马斯蓝G -250/ml 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量/ g20406080100取10ml 刻度试管6只以100μg 标准蛋白液为母液配制成0、20、40、60、80、100的系列浓度蛋白液 即：在6支试管中分别加蛋白液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,并加蒸馏水 在各试管中加考马斯蓝G -250，摇匀 在595nm 下，测定各管吸亮度 以蛋白含量为横轴，A595为纵轴，绘制标准曲线595计算：实验测得马铃薯提取液的吸亮度值为0.106由Y=0.0059x得x=0.106/0.0059 =17.97μg/ml蛋白含量=m w ▪1000×V 总V1=17.970.9956×1000×250.5=0.902 六、讨论1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min 内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。

过氧化物酶（POD）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。

（2）、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL（如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次（4min）。

以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。

表1 紫外吸收法测定POD酶活性配置表管号S0（对照）S1（实验）S2（实验）反应混合液(ml) 3.0 3.0 3.0KH2PO4 (ml) 1.00.00.0酶液 (ml)0.0 1.0 1.04.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。

也可以用每min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

POD总活性[u/g(FW)]=FWtV.VA T⨯⨯⨯⨯147001∆式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。

过氧化物酶活性的测定一、实验目的掌握酶活性的测定方法和原理。

二、实验原理过氧化物酶是一种含铁卟啉的氧化酶，是利用H2O2将代谢中一些化合物氧化,其活性与呼吸作用、光和作用等一些生理过程有关。

测定过氧化物酶的活性变化是植物生理和病历上一个常用的指标。

在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm的吸光度变化测定过氧化物酶活性。

三、材料、设备和试剂新鲜马铃薯块茎容量瓶（25ml）、量筒（25ml）、移液管（1ml）、研钵、试管架UV-9200紫外可见分光光度计、天平、秒表0.2M磷酸缓冲液（pH6.0）：将0.2M NaH2PO4溶液87.7ml与0.2M Na2HPO4溶液12.3ml混合反应混合液四、实验方法4.1制备酶液：4.2活性测定：值为纵坐标，绘制酶促反应曲线，计算酶的相对活性。

过氧化物酶活性=(△OD470*Vt)/(W*Vs*0.01*t)[u/(g·min)]其中：△OD470为反应时间内吸光值的变化；W为样品质量；t为反应时间；Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时酶液体积。

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离种子蛋白质一、实验目的学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠), SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小.当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k,b 均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量，从而根据分子量将混合蛋白质分离开。