Trizol法提取总RNA Protocol

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Trizol法提取总RNA

Trizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是基于氯仿-异硫氰酸胍的试剂，能够迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。通过将样品与Trizol试剂混合，可以裂解细胞并释放出RNA。然后加入氯仿进一步抽提RNA，并通过离心分离出上清液中的RNA。最后通过乙醇沉淀和洗涤得到纯化的RNA。

所需试剂和耗材

1. Trizol试剂：用于细胞裂解和RNA的释放。

氯仿：用于抽提RNA。

3. 无水乙醇：用于洗涤沉淀的RNA。

4. DEPC水：用于制备无RNA酶的水。

5. 1.5ml Eppendorf管：用于RNA的存储。

6. Tips：用于吸取无RNA酶的水和Trizol试剂。

实验仪器

1. 台式高速离心机：用于离心分离RNA。

2. 涡旋振荡器：用于混合样品和试剂。

3. 移液器：用于吸取试剂和样品。

4. 无菌微量离心管：用于样品和试剂的存储。

5. 无菌手套：用于防止RNA酶的污染。

准备工作 1. 在实验前需要将实验区域和所有实验用具进行清洁和消毒，以避免RNA酶的污染。

2. 使用Trizol试剂前需仔细阅读说明书，并确保按照说明书的要求进行操作。

3. 为避免RNA酶的污染，需要穿戴无菌手套进行实验操作。

实验方法

1. 准备无菌的DEPC水，加入DEPC水至10ml，然后加入10μl的氯仿，充分混匀后放置备用。

2. 在无菌的1.5ml Eppendorf管中加入100μl的Trizol试剂，加入10μl的氯仿，充分混匀后加入步骤1中制备好的DEPC水-氯仿混合液100μl，再次充分混匀后放置备用。

3. 将样品加入到步骤2中制备好的溶液中，充分混匀后加入氯仿，再次充分混匀后进行高速离心，分离出上清液。

4. 将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的无水乙醇，充分混匀后进行高速离心，收集沉淀的RNA。

5. 用70%乙醇洗涤沉淀的RNA，去除残留的乙醇和盐类，最后将RNA沉淀干燥后重新溶解在水中或指定的缓冲液中。

注意事项

1. 在加入氯仿之前，不要洗涤细胞，以免降解mRNA。 2. 在整个实验过程中，需要避免RNA酶的污染，因此必须戴手套，使用RNase-free的物品和试剂，并在无尘的环境中进行实验。

3. 在加入氯仿后，一定要充分混匀，以保证氯仿与Trizol试剂和样品充分接触。

4. 在高速离心时，要保证离心机的高速和稳定性，以避免RNA的损失。

TRIZOL同时提取RNA和蛋白

TRIZOL（invitrogen life techologies）

一． RNA提取

1. -80oC取标本

2. 取组织

3. 液氮中陶瓷研钵研磨，组织呈粉状时转移到预先称重的5毫升的塑料离心管中，离心管需要DEPC水处理后，灭菌。称重，得组织100mg

4. 加入TRIZOL （-60 oC—-70oC下，可存放1个月）

5. 室温保温5min

6. 加入氯仿，盖紧手震动混匀15s

7. 室温2-3min

8. 4 oC，12000g 15min

9. 取上清约，转移到离心管中，管子处理同上，去净上清的中下层液体用于DNA和蛋白质的提取

10. 加异丙醇，混匀，室温下10min

11. 4 oC，10000g 10min

12. 弃上清，加 75%乙醇（以DEPC处理灭菌水配制）混匀

13. 4 oC，7000g 5min

14. 弃上清，室温干燥5min

15. DEPC处理灭菌纯水100l溶解，-70 oC保存

二． DNA提取

1. 去净上清的中下层液体约，加入100%乙醇，混匀

2. 室温下2-3min

3. 4 oC，5000g 5min

4. 去除液体，可保留用为蛋白提取

三．蛋白质提取

1. 转移上清到5ml的离心管中，大约体积为1ml

2. 加入异丙醇（mlTRIZOL），室温下保温10min

3. 4 oC，12000g 10min

4. 加入3ml（2ml/mlTRIZOL）含盐酸胍的95%乙醇，室温下20min

5. 4 oC，7500g 5min

6. 重复洗涤3次

7. 加入2ml乙醇，室温下20min

8. 4 oC，7500g 5min

9. 真空干燥蛋白沉淀5－10min，1%SDS溶解

10. 完全溶解需要在50 oC保温，不溶物可4 oC 10000g 10min离心去除

11. 上清转移至新管，可用于Western blotting或－20oC存放

Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)

Trizoｌ法使用步骤

一、分离纯化得基本原理

研究基因得表达与调控时常常要从组织与细胞中分离与纯化ＲＮA。ＲNA质量得高低常常影响cＤNA库,ＲT-PCＲ与Ｎorthern Ｂloｔ等分子生物学实验得成败。Ｔrizol就是一种新型总ＲNＡ抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出得核酸酶。

二、用户需自备得试剂与材料

无水乙醇、氯仿、Ｇlycｏgen(可能需要)、 1、５ｍｌ Eppeｎｄｏrf管(ＲNase-frｅe)、 Tips(ＲNase－free)

三、准备工作

RNａse酶非常稳定,就是导致ＲNＡ降解最主要得物质。它在一些极端得条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规得高温高压蒸气灭菌方法与蛋白抑制剂都不能就是ＲＮase完全失活。它广泛存在于人得皮肤上,因此,在与RＮA制备有关得分子生物学实验时,必须戴手套。

RNase得又一污染源就是取液器,根据取液器制造商得要求对取液器进行处理。一般情况下采用用ＤEPC（焦炭酸二磷脂,一种ＲＮａse抑制剂)配制得7０％乙醇擦洗取液器得内部与外部,基本达到要求。取ＲＮａｓｅ－free得物品时必须戴手套。

1、料制品得处理

尽可能使用无菌,一次性塑料制品，已标明RNasｅ-Fｒee 得塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下:

1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEＰＣ使DEＰC得终浓度为０、1%。注意:DEPＣ为剧毒物,活性很强，小心在通风柜中使用。

2)处理得塑料制品放入一个可以高温灭菌得容器中,注入ＤEPC水溶液,使塑料制品得所有部分都浸泡到溶液中。

3)在通风柜中室温处理过夜。

4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已ＤEＰＣ水处理过得塑料制品得

烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5）烘箱用合适得温度烘拷至干燥。置于干净处备用。

Trizol法提取细菌总RNA

个人收集整理-ZQ

1 / 3 实验三法提取细菌总

一、实验原理

主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使释放出来地同时，保护地完整性.加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层.存在于水样层中.收集上面地地水样层后，可以通过异丙醇沉淀来还原.无论是人、动物、植物还是细菌组织，法对少量地组织( )和细胞(×)以及大量地组织(≧ )和细胞(>)均有较好地分离效果.试剂操作上地简单性允许同时处理多个地样品.所有地操作可以在一小时内完成.抽提地总能够避免和蛋白地污染.b5E2R。

二、主要试剂和器材

溶液氯仿异丙醇乙醇水

超净工作台离心管（无）移液枪紫外分光光度计

石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌

三、实验步骤

（一）. 采用溶液提取细菌地总

. 挑取大肠杆菌菌单菌落，培养至稳定期，取菌液于离心管离心得菌体；

、每管加入溶液，盖紧管盖，激烈振荡，室温静置 ℃，，离心；取上清转入(约 )新地离心管中；p1Ean。

、每管加入地氯仿( 体积 )，盖紧盖，剧烈振荡；室温静置；℃, , 离心；小心吸取上层水相，转入另一新地离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化.）DXDiT。

、加入倍体积地氯仿，盖紧盖，剧烈振荡；室温静置；℃，，离心；小心吸取上层水相，转入另一已编号新地离心管；RTCrp。

、加入地异丙醇( 体积 )，轻轻颠倒混匀；室温，静置；℃，，离心，

沉于管底；小心吸去上清；5PCzV。

、加地乙醇(预冷)，并轻柔颠倒，洗涤沉淀；℃，，离心；

小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁；

、各管用 μ 处理过地双蒸去离子水溶解，℃温育，分装，℃贮存(可贮存周)；

（二）. 浓度地测定个人收集整理-ZQ

2 / 3 取 µ 样品以双蒸水稀释至，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干地石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积地双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定、地光吸收值，根据公式计算地浓度.jLBHr。

TRIZOL同时提取RNA和蛋白 2