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RNA提取方法一、改良异硫氰酸胍提取法试剂及其配制异硫氰酸胍变性液：贮存液－在含484ml 水（经DEPC处理）, 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。
贮存液室温保存备用（不超过3个月）。
工作液－在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。
工作液于室温下保存不超过1个月。
工作液各成分的终浓度为：4mol/L异硫氰酸胍25mol/L柠檬酸钠pH 7.00.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)0.1mol/L巯基乙醇(2-ME)其它溶液：2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0)水饱和酚（pH 3.5）49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇100%异丙醇70%乙醇（用DEPC处理水配制）DEPC处理后高压灭菌水试验程序1．取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。
2．将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml异硫氰酸胍变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。
3．顺序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇1ml，每加入一种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。
4．4℃条件下15000g离心30min.，将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
5．4℃条件下13000g离心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml异硫酸胍变型液中（体积为第一次变性液的1/3），再加入等体积的异丙醇，混匀后置于－20℃冰箱冷冻1h.。
6．4℃条件下13000g离心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于适量体积（50μg/100μl）的DEPC处理水中，检测后分装，置于－70℃低温条件下保存。
Northern?blot技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。
含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。
尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。
1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L乙二醛μlDMSO μlL磷酸μlRNA（多达10μl）μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。
由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20℃。
每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。
L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将1mol/L磷酸二氢钠、1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用D EPC处理上述溶液后高压灭菌。
每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg 细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加poly(A)+RNA。
2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。
3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用％琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品，而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。
用0mmol/L 磷酸钠（pH7. 0 ）后，降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。
northern印迹杂交原理北方印迹杂交（Northern blot）是一种用于检测和分离特定RNA序列的实验技术。
它是南方印迹技术的衍生物，南方印迹技术是用于检测和分离DNA序列的一种实验技术。
北方印迹技术常用于研究基因的表达调控机制和RNA水平的变化。
北方印迹杂交的原理基本上与南方杂交的原理相似，但有一些具体差异。
北方印迹的主要步骤包括RNA提取、转印到膜上、固定RNA到膜上、杂交和检测。
首先，从细胞或组织中提取总RNA。
通常使用酚-氯仿法或商业RNA 提取试剂盒进行提取。
在提取过程中，应严格遵循消毒和无RNase污染的条件。
接下来，将提取的RNA样品加载到琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
通过电泳可以将RNA按分子大小进行分离，从而得到RNA带。
在电泳结束后，在凝胶上用碱性溶液溶解凝胶，将RNA转移到尼龙或硝酸纤维膜上。
然后，固定RNA到膜上。
这通常是通过使RNA与膜上的阳离子进行静电相互作用来实现的。
可以使用UV交联来增强RNA与膜的结合。
在固定RNA后，开始进行杂交。
杂交是将与目标RNA序列具有互补序列的DNA或RNA探针与膜上的RNA进行配对。
探针可以是标记有荧光物质或放射性同位素的分子探针。
探针的选择应根据研究的具体目的来确定。
杂交的条件包括温度、时间和杂交液的组成。
温度通常选择在50-65摄氏度之间，时间通常在几小时到一夜之间。
杂交液中通常包含盐、DENHART's溶液、聚丙烯醇等。
最后，进行检测。
检测的方法可以是放射自显影、化学发光或荧光检测。
如果使用放射性标记的探针，可以使用放射自显影技术来检测。
如果使用化学发光或荧光标记的探针，可以使用相应的检测仪器进行检测。
北方印迹杂交技术可以用于许多研究领域，例如研究基因表达的调控机制、RNA的稳定性和降解等。
它的优点包括对RNA分子的特异性检测和分离，以及对研究RNA变化的敏感性和定量性。
它的局限性在于需要较长的处理时间和较大的RNA样品量，以及需要较高的实验技术要求。
Southern杂交和Northern杂交是两种常用的分子生物学技术，它们主要通过探针与DNA序列互相配对来检测目标DNA片段是否存在，并确定其大小和数量。
Southern杂交：Southern杂交是一种检测DNA序列的技术，它利用DNA探针与杂交物中的目标DNA 特异性结合，来检测目标DNA序列的存在和数量。
这种方法一般应用于DNA分子量较大的靶标（如基因、整个染色体等）的检测，可以用于鉴定基因的剪接等多种分子生物学研究。
Southern杂交的原理是将DNA样本在电泳板上进行电泳分离，然后用互补的DNA探针杂交分离出目标DNA，在膜或凝胶上通过探针与目标DNA结合来检测。
Northern杂交：Northern杂交是一种检测RNA序列的技术，它利用RNA探针与杂交物中的目标RNA 特异性结合，来检测目标RNA序列的存在和数量。
这种方法一般应用于研究基因表达调控、细胞信号转导和病理生理等方面。
Northern杂交的原理与Southern杂交类似，也是先将RNA 样本在凝胶上进行电泳分离，然后用互补的RNA探针进行杂交分离出目标RNA，在膜或凝胶上通过探针与目标RNA结合来检测。
Southern杂交和Northern杂交的应用：Southern杂交和Northern杂交技术广泛应用于分子生物学、遗传学及生命科学领域。
它们可以用于：1. 检测基因的表达和剪接变异等2. 研究基因家族和功能3. 鉴定细胞中的某一DNA或RNA序列的存在4. 研究基因转录和翻译的调控机制5. 检测突变或重组基因的存在6. 进行基因诊断和疾病基因筛查等除了上述的应用外，Southern杂交和Northern杂交技术还可以广泛应用于以下领域：1. 植物和动物遗传图谱的构建：能够通过探针与DNA或RNA序列的配对来研究基因表达、调控和功能等信息，对于植物和动物的遗传图谱构建有重要的意义。
2. 生物安全监测：利用Southern杂交和Northern杂交技术可以检测到转基因食品或者是非法贩卖的野生动物制品等违法行为，具有重要的生物安全监测作用。
核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）（一）Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
（二）Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
（三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。
northern印迹杂交操作步骤标题：Northern印迹杂交技术的操作步骤详解Northern印迹杂交是一种研究基因表达的分子生物学技术，主要用于检测细胞中特定mRNA的存在和数量。
其基本原理是利用核酸之间的碱基配对原则，将放射性或非放射性的DNA探针与固定在硝酸纤维素膜上的RNA进行杂交，然后通过显影、放射自显影或者化学发光等方式显示结果。
以下是Northern印迹杂交的基本操作步骤：1. RNA的提取：首先从待测样本中提取总RNA。
常用的RNA提取方法有酚氯仿法、Trizol法等。
提取后的RNA需要进行定量和质量检查，以确保后续实验的准确性。
2. RNA的电泳分离：将提取到的总RNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。
根据RNA的大小不同，会在凝胶上形成不同的条带。
通常情况下，28S rRNA的迁移速度比18S rRNA慢，因此可以根据这两个条带的位置和强度来判断RNA的质量。
3. RNA的转移：将电泳分离后的RNA通过毛细管作用转移到硝酸纤维素膜上。
这个过程称为“转膜”。
转膜时需要注意的是，硝酸纤维素膜的正反两面不能混淆，因为转膜后要进行的杂交反应只在膜的一面上进行。
4. RNA的固定：转膜后的RNA需要被固定在硝酸纤维素膜上，防止其在后面的杂交过程中脱落。
常用的固定方法是在高盐溶液中进行热处理。
5. 杂交：将标记好的DNA探针与固定的RNA进行杂交。
杂交过程一般在恒温水浴中进行，温度应设定在Tm值以下5℃左右。
杂交的时间视探针的长度和浓度而定，一般为过夜。
6. 洗脱：杂交后的硝酸纤维素膜需要进行洗涤，目的是洗去未与RNA杂交的游离探针。
常用的洗涤液是SSC缓冲液，洗涤次数视具体情况而定。
7. 显影：将洗涤后的硝酸纤维素膜用X光片覆盖，并放置在暗盒中曝光一段时间，然后进行显影。
如果使用的是放射性标记的探针，则需要进行放射自显影；如果是非放射性标记的探针，则可以采用化学发光的方式进行显影。
总的来说，Northern印迹杂交是一种相对传统的分子生物学技术，虽然操作步骤较为繁琐，但因其能够直接反映mRNA的存在和量的变化，因此在基因表达的研究中仍具有重要的地位。
Northern 杂交（Northern blotting）1979年，J.C.Alwine等提出：将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用使它们结合，因其方法同Southern杂交十分相似，故称之为Northern杂交。
1 原理Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。
2实验流程RNA混合物进行琼制糖凝胶电泳→分离得到的RNA转膜→与放射性标记的探针杂交→结果分析3 特点Northern杂交与Southern杂交相比，条件要严格些，特别是RNA容易降解，前期制备和转膜过程易受RNase污染，要获得较好结果，需用稳定性最差的mRNA与DNA进行杂交，对实验条件要求严格；然而有些应用中Northern杂交避免用复杂探针筛选cDNA 文库的繁琐4应用Northern杂交技术应用于特定性状基因在mRNA水平上的动态表达研究。
如应用于定位克隆中寻找新基因，寻找染色体特定区域的表达序列使大多数人类遗传疾病连锁分析和定位克隆的主要限速步骤，Northern杂交作为寻找这些序列的有效方法，有助于这些疾病候选基因的筛选；Northern杂交分析【操作】1．RNA的提取见前。
2．变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入 DEPC H2O 12.4ml，加热熔化，冷却至60℃时加入5×甲醛凝胶电泳缓冲溶液4.0 、37%甲醛3.6ml、混匀、制胶。
待胶凝固后，置于1×甲醛凝胶电泳缓冲溶液中预电泳5min。
3．样品制备取总RNA4.5 ，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲溶液4.0 、37%甲醛3.6 、甲酰胺10、于65℃温浴15分钟,水浴冷却。
加入上样缓冲液2 。
southern杂交和northern杂交的原理和应用杂交是指由不同基因型的个体交配而产生的后代。
南方杂交和北方杂交是两种不同的杂交方式，它们有着不同的原理和应用。
南方杂交是指将两个具有显著不同的基因型的个体进行交配。
这两个个体通常分别来自不同的地理区域，其中一个个体来自南方而另一个来自北方。
这种杂交的目的是将两个个体的有益特性结合在一起，以产生更适应广泛环境的后代。
南方杂交的原理是，南方个体常常具有较高的抗病性和更好的适应性，而北方个体则通常具有较高的生产力和耐寒性。
通过将这两种特性结合在一起，可以得到既具有高产性、适应广泛环境又具有较强抗病性的后代。
这种杂交可以在农业、畜牧业和林业等领域中应用，以提高作物、动物和树木的产量和耐受性。
北方杂交是指将两个具有显著不同的基因型的个体进行交配，其中一个个体来自北方而另一个来自南方。
这种杂交的目的是将两个个体的有益特性结合在一起，以产生适应北方环境的后代。
北方杂交的原理是，北方个体常常具有更好的耐冷性和更高的适应性，而南方个体则通常具有较高的生产力和更好的抗病性。
通过将这两种特性结合在一起，可以得到既具有适应北方环境又具有较高产量和较强抗病性的后代。
这种杂交可以在农业、畜牧业和林业等领域中应用，以提高作物、动物和树木在寒冷地区的适应性和产量。
南方杂交和北方杂交的应用在农业方面具有重要意义。
通过这些杂交方式，人们可以选择具有不同特性的个体进行交配，以产生具有更好适应性和生产力的后代。
这可以提高农作物的产量和耐受性，并减少对农药和化肥的需求。
此外，这些杂交还可以提高作物的抗病性，减少病害对农作物的危害。
在畜牧业方面，南方杂交和北方杂交可以提高家畜的适应性和产量，改善肉质和乳质，并减少疾病的传播。
在林业方面，这些杂交可以提高树木的生长速度和适应性，增加木材的产量和质量。
总之，南方杂交和北方杂交是两种重要的杂交方式，它们利用不同地理区域的个体的有益特性，通过交配将这些特性结合在一起，产生更适应广泛环境的后代。
northern杂交的基本步骤
嘿，朋友们！今天咱来聊聊 northern 杂交那些事儿哈。
你知道不，northern 杂交就像是一场精心编排的舞蹈，每个步骤都得恰到好处呢！首先啊，得准备好咱的“舞台”，也就是提取高质量的RNA。
这可不能马虎，就好比建房子得有牢固的地基一样。
要是 RNA 质量不行，那后面的步骤可就都白搭啦！这提取 RNA 就像是挑选最甜的水果，得仔细着呢！
然后呢，就是电泳啦！把 RNA 放到凝胶上，让它们在电场里欢快地奔跑起来。
这凝胶就像是一条跑道，RNA 分子们在上面你追我赶，展示着自己的独特魅力。
这时候可得瞪大了眼睛，好好观察它们的表现哟！
跑完电泳，接下来就是转膜啦！就像是把跑道上的选手们转移到另一个更舒适的场地一样。
这个过程要小心再小心，可不能把咱的“宝贝”RNA 给弄丢了或者弄伤了呀。
之后呢，就是预杂交和杂交啦！这就像是给 RNA 们举办一场盛大的派对，让它们和特定的探针尽情地交流、结合。
这可需要合适的温度和条件，就像派对得有合适的氛围一样。
最后，就是检测啦！看看咱的 RNA 们和探针结合得怎么样，有没有成功地完成这场“约会”。
这检测就像是看一场精彩的演出，等待着最后的惊喜和成果。
哎呀呀，这 northern 杂交的步骤虽然听起来挺复杂，但只要咱一步一步认真去做，肯定能得到满意的结果呀！就像学骑自行车一样，刚开始可能会摇摇晃晃，但多练习几次，不就稳稳当当啦！咱搞科研也是这个理儿，别怕困难，勇往直前！大家加油哇，让我们在 northern 杂交的世界里尽情探索，发现更多的奥秘哟！。
northern印迹杂交名解-回复Norther印迹杂交名解引言：近年来，园艺植物领域中出现了一个新的名词——"Norther印迹杂交"。
这一名词不仅引起了园艺爱好者们的关注，也受到了广大植物学家的研究。
那么，什么是Norther印迹杂交？为什么它受到了如此多的关注？本文将一步一步回答这些问题。
第一部分：Norther印迹杂交的定义Norther印迹杂交是一种植物繁育技术，它在传统杂交的基础上，加入了新的技术和方法。
这种繁育方式是由园艺学家John Norther于二十一世纪初提出的，旨在提高植物的生长能力、抗病能力和抗逆性。
第二部分：Norther印迹杂交的原理Norther印迹杂交的原理基于对植物基因组的深入研究。
通过分析植物基因组的序列和结构，我们可以了解到一些基因与植物性状之间存在的关系。
Norther印迹杂交通过混合两个具有不同性状的亲本，使它们的基因组发生重组，形成一种新的植物。
这种新的植物结合了亲本的优点，并在某些方面表现出更强的性状。
第三部分：Norther印迹杂交的优点Norther印迹杂交的最大优点是提高了植物的生长能力和适应环境的能力。
通过选择适宜的亲本进行杂交，能够增加植物的抗逆性，使其能够更好地适应气候变化、病虫害等外界环境的影响。
此外，Norther印迹杂交还可以提高植物的产量和品质，满足人们对农作物的需求。
第四部分：Norther印迹杂交的应用Norther印迹杂交在园艺植物领域的应用非常广泛。
它被广泛应用于粮食作物、果树、蔬菜等农作物的繁育中。
通过Norther印迹杂交，可以培育出更耐旱、耐寒、抗病虫害的农作物品种，提高农作物的产量和质量。
此外，Norther印迹杂交在园艺植物的观赏价值提升方面也有着广泛的应用。
通过Norther印迹杂交，可以培育出更加美丽、耐看的花卉和观叶植物。
这些新品种不仅迎合了人们对美的追求，也丰富了园林植物的种类和样貌。
Northern blot技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。
含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。
尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。
1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L乙二醛 5.4μlDMSO 16.0μl0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μlRNA（多达10μl） 5.4μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。
由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－2 0℃。
每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。
0.1mol/L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。
每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg 细胞总RN A进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。
2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。
3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4 ％琼脂糖分析1kb 以下的R NA样品，而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。
用0mmol/L 磷酸钠（pH7. 0 ）后，降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。
用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％H2O2，于室温放置10分钟后，用经D EPC处理的水彻底冲洗电泳槽。
因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。
4）将RNA样品冷却至0℃，加入4μl 灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛－DMSO凝胶中样缓冲液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。
用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28S rRNA或或9S兔β－珠蛋白mRNA，上述RNA长度分别为6322、2 366和710个碱基。
也可以从BRL购置已知大小的RNA混合物作为分子量标准照物。
通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。
乙二醛－DMSO凝胶加样缓冲液50％甘油10mmol/L磷酸钠（pH7.0）0.25％溴酚蓝0.25％二甲苯青FF5）将凝胶浸入10mmol/L磷酸钠电泳液中，以3－4V/cm电压降进行电泳，同时按图7.1对磷酸钠容液时行持续再循环，使溶液pH值维持在可被接受的限度内（pH>8.0时乙二醛将从PNA分子上解离）。
另一方法为电泳时每30分钟换一次磷酸钠缓冲液。
6）电泳结束后（溴酚蓝迁移出区8cm），切下分子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化忆锭溶液（0.5μg/ml，用0.1mol/L乙酸铵配制）中染色30-45分钟。
在凝胶放置一透明迟，在紫外灯下照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RPN片段大小的lg对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小。
7）RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，将RNA转移至尼龙膜。
将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。
毛细管洗脱法如下所述，真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。
尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983），但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛。
如果琼脂糖中浓度大于1％或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。
然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜，RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。
1）将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。
2）用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿内，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20xSSC使液面略低于平台表面，当平上方的3MM滤纸温透后，用玻棒赶出所有的气泡。
3）用一把新的解剖刀或切纸刀裁一张硝酸纤维素滤膜（Schleicher ＆Schuell BA85或与之相当的产品）。
滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大1mm，接触滤膜时须戴手套或用平头镊子（例如Millipore镊子），用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸温。
4）将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用20xSSC浸泡滤膜至少5分钟，用干净的解剖刀片切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。
不同批号的硝酸纤维膜，其浸湿速率相差悬殊。
如滤膜池浮在水面上几分钟后仍未湿透，应另换一张新滤膜，因为未均匀浸湿的滤膜进行RNA转移是靠不住的。
这种滤膜也不必丢弃，可将其夹在用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，高压5分钟。
通常上述处理足以使硝酸纤维素滤膜湿透。
高压处理的滤膜应夹在经过高压理理并用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，装入塑料袋，密封后于4℃保存备用。
5）将凝胶翻转后置于平台上温润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。
6）用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。
并非堆放得十分整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中的RNA的转移效率下降的主要原因。
7）在凝胶上方放置温润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。
滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。
滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝交之间不应留有气泡。
8）用2xSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸，温润的放置在湿润的硝酸纤维滤膜上方。
用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。
9）切一叠（5－8cm高）略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方。
并在纸巾上方放一块越境玻璃板，然后用－500g的重物压实。
其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。
10）使上述RNA转移持续进行6－18小时，每当纸巾浸湿后，应换凝的纸巾。
11）转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的3MM滤约纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。
12）从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。
以6x SSC溶液于室温浸泡滤膜5分钟，这一步可以除去粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。
从6xSSC溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。
于室温晾干30分钟以上。
为估计RNA的转移效率，可将胶置于溴化乙锭溶液（0. 5 μg/ml ，以0.1mol/L乙酸铵配制）中染色45分钟，于紫外灯下观察。
13）将晾干的滤膜放在两经张3MM滤纸中间，用真空炉于80℃干烤0.5-2 小时。
如干烤时间过长，滤膜极易脆裂并可能发黄。
如果滤膜并不立即用于杂交实验，可用铝箔宽松地包裹起来，在真空下贮存于室温。
14）仅适用于滤膜上含有乙醛酰PNA的情况：杂交前需用20mmol/L Tris.Cl(pH8.0)于65℃洗膜，除去RNA上的乙二醛分子。
（三）转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的ＲＮＡ染色当ＲＮＡ自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前，溴化乙锭的染色时间一般不宜过长，这是因为被染料饱和的核酸分子，其转移效率有所降低。
然而，用溴化乙锭作短暂染色，既不至于对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用，又独具同时检测凝胶和凝膜上的ＲＮＡ的优点。
１．方法Ｉ１）电泳结束后，含乙二醛－ＤＭＳＯ的凝胶应浸入含溴化乙锭（0.5 μg/ml）的10mmol/ L磷酸钠（pH7.0）溶液。
甲醛凝胶需用无ＲＮＡ酶的水淋洗，用20xＳＳＣ溶液浸泡，随后用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的20xＳＳＣ溶液染色。
２）于室温染色５－１０分钟，在紫外灯下观察，照像。
３）按前所述方法，将凝胶中的ＲＮＡ转移至硝酸纤维素滤膜，转移后能常在学光下也可看出已染色的ＲＮＡ条带。
这种方法仅适用于每一泳道均含有相当大量（如５μg 以上）的ＲＮＡ的情况。
２．方法Ⅱ硝酸纤维素滤膜上的ＲＮＡ也可以用下述方法染色：从干烤后的硝酸纤维素滤膜上剪下所需的条带进行染色，也可以用经过杂交并经Ｘ光片曝光后的整张滤膜进行染色（Ａ.Ｅfstr atiadis,未了表材料）。
１）将干燥的滤膜浸入５％冰乙酸中，于室温浸泡15分钟。
２）再将滤膜转移至0.5mol/L乙酸钠（pH5.2）、0.04％亚甲蓝溶液中，于室温浸泡５－１０分钟。
３）用水淋洗滤膜５－１０分钟后，可见ＲＮＡ分子量标准参照物带型锐利而poly(A)+mR NA为一模糊带型，由许多长度范围从500碱基以下至５kb以上的各种mＲＮＡ共同组成，m ＲＮＡ的平均长度约为２kb。
杂交和放射自显影固定于滤膜上的RNA的预杂交、杂胶及淋洗等条件，与DNA杂交的相应条件基本相同。
现简述如下1）用下列两种溶液之一进行预杂交，时间1－2小时。
若于42℃进行，应采用。
50％甲酰胺5xSSPE2xDenhardt试剂0.1％SDS若于68℃进行，应采用：6xSSC2xDenhardt试剂0.1％SDS2）在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，如欲检测低丰度mRNA，所用探针的量至少为0.1μg，其放射性比活度应大于2x108计数/（分．μg）在适宜的温度条件下继续温育16-24小时。
切记RNA只与双链DNA中一条单链互补，因此如用单链探针，则必须是能与RNA互补的一条单链。
3）用1xSSC、0.1％SDS于室温洗漠20分钟，随后用0.2xSSX、 0.1％SDS于68℃洗膜3次每次20分钟。
