下载文档原格式
裸鼠肿瘤接种技术实验操作方法裸鼠肿瘤接种一般有细胞接种和瘤块接种两种方式，接种取材有手术活检标本、癌性胸腹水标本和体外培养的细胞系三种。
l楼主看来是做体外培养的细胞的裸鼠接种，一般用带6号针头的注射器取适量细胞悬液注射于裸鼠的皮下，部位看试验要求而定，一般在腋下或背部皮下，每个接种部位注射0.1-0.2ml。
就是将培养的细胞收集起来调整到适宜浓度重悬于不含血清的培养液或PBS中，放于冰盒中携至动物房，直接注射即可。
是牵涉到细胞株的成瘤性问题，可以通过增大细胞悬液浓度的办法来解决。
一般细胞浓度可在1*10的6次方到5*10的7次方之间，浓度再大就可能打不进去了。
具体浓度需要查相关文献。
如果成瘤率太低，可以通过把瘤块在裸鼠身上传2—3代的方法提高成瘤率，即将已成瘤鼠的瘤块取出接种于新鼠身上，成瘤后再取出接种新鼠，如此传几代，肿瘤性质稳定后，再将肿瘤取出，剪碎、研磨、匀浆成为细胞悬液后再接种。
一、可移植性肿瘤的建立方法1．腹水瘤的建立将动物实体瘤细胞注入受体动物腹腔内，或将实体疤移植于受体动物的腹壁内，肿瘤生长后引起腹水，腹水内含高大量瘤细胞可移植传代．即为腹水瘤。
建议腹水瘤初期、腹水往往是血性，多次传代后逐渐变为乳白色的瘤性腹水。
腹水如培养基一样供给瘤细胞生长所需的营养。
若将腹水瘤细胞注入皮下，又可形成实体瘤。
由于瘤细胞游离在腹水内，因此总呈圆形，体积可有大、中、小之分c：r．在一些细胞边缘偶见大小不等的泡状突起，称之为“鼓泡”。
一般在接种后第5天时核分裂相达高峰。
偶见三吸或四极分裂。
二、肿癌移植方法1．常规保种传代方法(1)腹水瘤移植方法：瘤源一般用接种后第5～6天的腹水，抽出的腹水以乳白色为佳。
接种应从下腹部件入受体动物腹腔，一般接种o．1一o．2m1。
可在腹水内加适量的抗凝药物。
(2)实体型肿瘤接种法：1)小块接种法：将瘤取出后，切开，选出生长良好而无变性坏死、呈谈红色、鱼肉状的瘤组织，切成小块(约5*5*5mm)；在受体动物腹部外例剪开—个小口，用无钩眼科镊子夹取小块，送入切口内皮下。
裸鼠成瘤实验原理及详细步骤从体外细胞试验到动物水平体内试验，是基因功能研究的重要飞跃。
动物实验，由于其更能模拟人类的生理和病理条件，在科研上，动物实验获得的结果，将有更强的说服力。
肿瘤研究中，最常规的动物实验就是裸鼠成瘤实验。
由于大部分肿瘤研究使用的是人类细胞，所以由于异种排斥的存在，我们需要免疫缺陷型小鼠来作为移植瘤模型的载体，通过对该小鼠的注射肿瘤细胞，使其成瘤，观察流体的生长来判断其生物学变化。
实验室常用的是BALB/c-nu裸小鼠,随着裸小鼠年龄增长或有关因素的影响(如病毒感染),裸鼠体内正常T细胞会增加，故接种肿瘤实验一般采用4--6周龄的裸鼠。
裸鼠成瘤实验技巧1、细胞的状态是成瘤实验的关键，所以细胞生长状态一定要好，取处于对数生长期的细胞，细胞达80-90%左右密度为宜。
收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。
2、胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗两遍，目的为去除细胞中残余的血清。
3、用PBS或者无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度，一般皮下瘤接种的细胞量为1-5×10^6个细胞/支，接种体积为0.1-0.2ml，因此细胞悬液的浓度为1-5×10^7个细胞/ml，如若有条件的实验室，也可以加基质胶以加速瘤块的生成，基质胶与PBS或无血清的比列为1:1。
4、细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下，一般尽量在半小时内完成（如果接种量大，可以分批接种），途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢以保持细胞的活性。
5、选择的裸鼠一般在4-6周龄，体重16-18g左右，种植部位选择血供丰富区域，如腋窝中后部。
6、接种前用枪将细胞悬液充分的吹散，防止细胞成团而降低细胞成活率，并且导致小鼠接种细胞数量的差异过大。
7、接种时，针头在皮下进针深一点，约1cm深，针头在皮下左右滑动几次，以便细胞接种成团，减少注射后细胞悬液从针眼溢出。
8、如何保定裸鼠?左手拇指和食指捏紧裸鼠颈背部皮肤，小拇指夹住裸鼠尾巴。
9、接种后1-2周左右可以见到皮下开始出现肿块。
关于肿瘤动物模型建立的方法生物实验菌推荐搜索关键词列表：动物模型光热治疗HE染色常规的动物实验，除了皮肤或者骨的缺损修复，癌症也是其中重要的一种。
目前，癌症仍然威胁人类的一大疾病，因此需要动物实验来深入了解如何有效进一步治疗癌症。
通常，动物模型一般是研究者利用化学致癌剂或者致癌病毒诱发实验动物肿瘤。
那么肿瘤动物实验模型建立的优点主要有：抗肿瘤药物的筛选以及疗效；抗肿瘤转移性药物的研发以及研究平台。
因此，我们总结了常见癌症的动物模型建立方法供读者参考。
一、肝癌（1）二乙基亚硝胺(DEN)诱发大白鼠肝癌：第一种方式可以用DEN直接灌胃（10mg/kg，每周一次），其余5天用0.025%的DEN 水溶液供其饮用，约4个月可以诱发成肝癌；另一种方式可以直接用0.005%掺入水中饮用约8个月即可诱发肝癌。
（2）2-乙酰氨基酸（2AAF）诱发小鼠、兔、狗肝癌：可以将0.03%的2AAF混入饲料喂养；或者每只每日喂养平均2～3mg的2AAF，3-4月左右即可诱发肝癌。
（3）4-2甲基氨基氮苯（DBA）诱发大鼠肝癌：将0.06%的DBA 混入饲料喂养，饲料中的维生素B2不可超过1.5～2mg/kg。
（4）黄曲霉素诱发大鼠肝癌：将0.001～0.015ppm（每日用量）的黄曲霉素混入饲料中喂6个月后，肝癌诱发率可达80％。
二、肺癌（1）二乙基亚硝胺（DEN）诱发小鼠肺癌：小白鼠每周皮下注射1%的DEN水溶液一次，每次剂量56mg/kg，总剂量达到1176mg，半年左右发癌率可达94%。
（2）乌拉坦诱发肺腺癌：适龄大鼠每次每只腹腔注入10%乌拉坦生理盐水液0.1～0.3ml，间隔3～5日再注，共注2～3个月，每只小鼠用量约为100mg。
3个月左右即可成功诱发肺腺癌。
（3）硫酸铵气溶胶诱发肺腺癌：让老鼠吸入硫酸胺气溶剂13个月即可诱发肺腺癌。
三、胃癌（1）不对称亚硝胺诱发小鼠胃癌：不对称亚硝胺的剂量为0.25ml/kg，3个月即可发生前胃乳头状癌，7-8个月诱发胃癌。
裸鼠移植瘤方法建立1.细胞准备：1.1用PBS 清洗细胞两遍，加入胰酶消化，吹打离心，无血清培养基清洗两次，然后用无血清培养基将细胞重悬，进行细胞计数，使得200μL 悬浮液里面含有1×107个细胞。
总共需要细胞: 18（只）*200ul*1.2=4.32ml×107个，将混合好的细胞放于4°C冰盒运至动物房。
2.裸鼠准备：2.1 3周龄小鼠饲养一周后，每只于右侧腋腹壁皮下接种MDA-MB-231和MCF-7细胞1×107/200μ L。
每日观察肿瘤生长情况, 待出瘤后使用游标卡尺测量肿瘤体积, 肿瘤体积=(D×d 2)/2(D表示肿瘤的长径, d表示肿瘤的短径)。
（注射器型号BD一次性使用无菌胰岛素注射器规格：1ml 25G）2.2 当肿瘤体积约为80 mm 3 时(100至150左右)，将裸鼠进行随机分成3 组（肿瘤大小，体重尽量接近），每组3只。
对照组，TO901317组，DADS组。
每天（每天给药？会不会太频繁？可以查阅相关类似成药的半衰期或综合国外文献的数据）将实验组灌胃TO901317，剂量为25mg/kg/d，将粉末状的TO901317 溶解到蓖麻油（或芝麻油以及生理盐水）里，每只裸鼠注射含有TO901317 的蓖麻油200μL；对照组注射等体积的蓖麻油。
连续注射两周。
（12号灌胃针头，每次用后一定要煮沸消毒）（灌胃进针时针头偏右，一般就不会进肺了）腹腔注射DADS，剂量为50mg/kg (含10%小牛血清的D ME M 培养液（最好使用生理盐水）)每次注射200 μL , 隔日注射, 连续7次给药。
2.3每2～3d观察测量1次, 计算肿瘤相对体积(RTV)。
以每组动物移植瘤体积的平均值, 绘制移植瘤生长曲线。
实验结束时在超净工作台上对裸鼠进行拍照，完整剥离肿瘤，用游标卡尺对肿瘤的大小进行测量，用电子天平称量移植瘤重量，用手术剪取出肿瘤，拍照。
裸鼠前列腺原位肿瘤模型的建立裸鼠前列腺原位肿瘤模型是研究前列腺癌的一种重要方法，可以帮助研究前列腺癌的发生机制、治疗方法以及预后。
在这篇文档中，我们将介绍创建裸鼠前列腺原位肿瘤模型的步骤和需要注意的事项。
一、实验动物选择当前，最常用的裸鼠前列腺原位肿瘤模型是使用BALB/c裸鼠进行实验。
这种鼠标品系的免疫系统极度压制，不会产生对异位移植物的免疫反应，从而提供了可行的肿瘤原位移植模型。
二、细胞株选择在建立裸鼠前列腺原位肿瘤模型的时候，选择合适的细胞株非常重要。
选择常用的前列腺癌PC-3和LNCaP细胞，或者使用病人前列腺癌细胞系，也可以根据需要转移所选原位移植物的特定表型。
三、移植前肿瘤细胞的处理肿瘤细胞的本质是异种细胞体，从人体获取到的肿瘤组织处理一般包括酶处理过程和细胞悬液制备过程。
酶液（例如胰酶）可以消化组织基质和纤维素，使细胞更容易生长。
酶液需要在恰当的温度和pH值下进行消化，并获得最高的细胞产量。
消化完毕后，过滤产生的细胞系悬液，以获得细胞。
四、移植前的裸鼠准备在移植前，要为裸鼠准备好阴茎垫和保持体温的设备。
可以使用小激光剪切器轻轻地切割皮肤做一个小孔，将悬液注入到前列腺内。
五、细胞移植移植前，应将细胞重新悬浮在适合的细胞培养基中，调整至合适的细胞浓度。
将细胞直接注入到头孢钠和甲苯磺丁脲等抗生素加载的BALB/c裸鼠前列腺中。
六、术后护理在移植完成后，将裸鼠安置在恰当的环境中，并监测它们的舒适程度。
为了预防感染和控制感染，需要注射抗生素和止痛药，以及监测患处的融合情况。
七、标本收集和肿瘤评估从移植的裸鼠体内收集原位移植物的标本，并用组织学方法鉴定癌细胞的形态学，确定癌细胞类型。
在肿瘤评估过程中，还可以进行微管道侵袭实验、体内药物毒理学试验等进一步的研究。
总之，裸鼠前列腺原位肿瘤模型的建立对研究前列腺癌的发生机制、治疗方法和预后等方面有重要意义。
从以上步骤和注意事项可以看出，建立该模型的过程繁琐，需要确保实验严谨，才能有效提高研究精度和推进前列腺癌的临床治疗。
肿瘤动物模型的构建第一类是皮下移植瘤顾名思义，这种模型的建立是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下。
种植的点也有讲究，一般选择血运淋巴回流丰富的腹股沟和腋窝。
可根据实验设计选择移植点，统一移植点的位置，除了遵守实验统一的条件外，待肿瘤成熟后收集肿瘤时留下照片证据也显得美观。
裸鼠（Balb/c 鼠，无毛发，T 淋巴细胞缺陷）是比较常见和常用的实验用鼠，尤其是在皮下移植瘤肿瘤模型的建立中起到重要作用。
裸鼠移植瘤模型的建立具有建立周期短、成瘤率高、易于操作、成本低的优点。
当然，这种肿瘤模型也有缺陷，即不能很准确的模拟正常人体肿瘤发生发展的过程。
肿瘤细胞移植时的简要步骤：首先准备好要移植的肿瘤细胞（细胞量根据不同肿瘤略有不同，我们所用的前列腺癌细胞系每个移植点一般选择1x106左右；肿瘤细胞可与基质胶1:1 混匀后用 1 ml 注射器吸取，基质胶能够给肿瘤细胞提供营养环境，有助于肿瘤细胞生长）。
戴无菌手套后，将小鼠用左手大拇指和食指捏住颈部皮肤，然后将鼠尾用左手无名指和小指固定于左手大鱼际。
将腋窝或腹股沟用75% 酒精消毒 3 次。
右手持吸有肿瘤细胞和基质胶混合液的注射器，在腹股沟或腋窝的位置，45 度斜角进针，注意不要突破腹膜，将针头保持于皮下位置。
然后近水平位置将针头几乎完全插入皮下，将混有基质胶的肿瘤细胞注射入皮下（肿瘤细胞量约1x106），快速退针，左手食指轻压针孔约1 min 后将小鼠放回饲养笼中，注意将小鼠侧放于垫料上，防止其不适呕吐时呕吐物误入呼吸道引起窒息。
2～3 h 后观察小鼠是否苏醒。
如果是利用肿瘤组织（人体肿瘤标本或小鼠移植瘤传代）建立裸鼠皮下移植瘤模型，则需要首先将肿瘤组织用无菌PBS（或1640 培养基）洗涤 3 次，然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成<1 mm3 体积的小块（种植前可裹基质胶）备用。
将小鼠用水合氯醛麻醉后平卧于解剖板上，四肢用胶带固定，将腋窝或腹股沟用75% 酒精消毒3 次，然后用眼科剪剪开约0.5 cm 小口，小镊子将皮下筋膜与皮肤分开，然后将肿瘤组织放入贴近腹股沟或腋窝的深部，每个位置放置2～3 块肿瘤组织，注意不同组间统一放置肿瘤组织块数以保持一致。
动物体内抑瘤实验具体步骤及方法活体生物发光成像技术的原理：在小型哺乳动物体内利用报告基因（荧光素酶基因）表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+存在的条件下消耗ATP 发生氧化还原反应，将部分化学能转化为可见光能释放。
因此只有在活细胞内才会发生发光现象。
并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。
一、材料准备1. 动物：裸鼠9 只，6～8周龄，雄性；C57小鼠24 只，6～8 周龄，雄性；动物均为自由饮水采食。
2. 细胞：MDA-MB-231人乳腺癌细胞系，使用荧光素酶基因标记。
方法：用荧光素酶报告基因标记的质粒转染人乳腺癌细胞，共转染的还有选择性标记基因，从而保证转染细胞的稳定性，形成表达荧光素酶的肿瘤细胞株；B16 黑色素瘤细胞。
二、实验步骤1. 紫杉醇混合胶束的制备（1）将适量紫杉醇溶解在少量无水乙醇和丙二醇的混合溶剂中.（2）加入适当比例的磷脂和表面活性剂A 进行充分混合，制得稳定的紫杉醇混合胶束前体制剂，载药浓度为6 g/L。
（3）临用时按剂量加入生理盐水中稀释、摇匀后即可使用。
制剂体系的粒径大小与分布特征采用动态激光光散射粒度仪检测。
2. MDA-MB-231人乳腺癌细胞荷瘤鼠模型的建立（1）培养荧光素酶基因标记的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系，使用DMEM 培养基（添加10%胎牛血清），37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，每3天传代1次。
（2）待细胞密度为80%～90%、细胞总量达到实验所需要求时，使用胰酶消化，收集于PBS溶液重悬。
（3）如有需要，在细胞培养一定时间后，应使用抗生素Zeocin进行抗性筛选，保证荧光素酶基因的表达量足够。
（4）收集细胞，使用PBS稀释至细胞数1.5×108/mL，接种于裸鼠腋下，每只裸鼠的接种量为0.1 mL 。
3. 动物活体成像检测（1）接种后将裸鼠随机分为3组，分别为生理盐水组、紫杉醇注射液组、紫杉醇混合胶束制剂组，每组3只。
原位移植肿瘤模型的制作1.肿瘤的来源：人的胸腹水，手术切除的肿瘤，小鼠自发或诱发的肿瘤，或者已经建系的肿瘤细胞株。
2.移植瘤的建立一般是选择自发瘤或诱发瘤组织块，或人的原代肿瘤细胞为佳。
已建立的肿瘤细胞株经过多次传代后，其生物学特性已发生一定程度的改变，如形态学上的改变、恶性程度以及转移特性的变化等3.移植瘤的接种方法1）腹水瘤移植接种法2）实体瘤移植接种法（1）小块接种法（2）肿瘤组织浆接种法：（3）培养细胞接种法4.腹水型肿瘤模型的制作常规复苏肿瘤细胞并培养，取指数生长期肿瘤细胞，离心收集，显微镜下细胞计数，调整细胞浓度为1×107／ml，取健康小鼠，无菌条件下每只小鼠腹腔接种细胞悬液0.2-0.5 ml，约8-10 d成腹水瘤。
5.皮下肿瘤模型的制作1）.细胞接种法：取腹腔接种肿瘤细胞7-l0d 、腹水生长良好的小鼠脱颈处死，无菌抽取腹水以生理盐水稀释调整细胞浓度为1×107／ml（一般以生理盐水l:2-l:3倍稀释），每只0.2 ml接种到小鼠腋窝皮下，建立小鼠皮下移植瘤模型。
抽出的腹水应为白色之浓稠液体为佳。
.直接将体外培养的指数生长期肿瘤细胞，离心收集，显微镜下常规细胞计数，调整细胞浓度为1×107／ml，取健康小鼠，无菌条件下每只小鼠皮下接种细胞悬液0.2 ml。
2）.组织块接种法：先用细胞接种法建立皮下肿瘤模型。
选择接种后7-l0d，肿瘤生长旺盛且无溃破的动物，脱颈处死后消毒操作部位皮肤然后切开，选择生长良好的瘤组织置于无菌平皿内(平皿内放置少许生理盐水或细胞培养液)。
将肿瘤组织剪成2-3mm的小块，向无菌套管内塞人一小块，接种于健康动物前腋窝皮下，整个接种时间应尽早可能短，一般不应超过30min。
如接种动物数较多，可制成细胞悬液进行接种，以上法切取生长良好的癌组织，剪成小块，用无菌玻璃研磨，磨匀后装人无菌容器内，加生理盐水稀释l:3-l:4的瘤细胞，每个动物接种0.2ml。
裸鼠肿瘤造模的一点经验分享1、取5-6周龄裸鼠饲养(此时大小约16-23g。
)。
虽然此时的裸鼠个头较小，但是，标准的做法与权威的文章都是如此。
考虑可能是此时裸鼠个体差异小，对实验数据影响小吧。
2、制备肿瘤细胞悬液，按5×10*6-2×10*7细胞/只(稀释成0.2ml)接种于裸鼠腹腔，形成腹腔种植瘤。
(小鼠腹水出现情况一般如下：5～6 d出现腹水，6～8d抽取传代最好，10～12 d出现血性腹水，14～15 d小鼠开始死亡。
)3、取腹水瘤，细胞数5×10*6-2×10*7，稀释成0.2ml接种于裸鼠前腋皮下。
4、加药。
根据使用药物的不同，方法各异。
时间上可以是24小时，或第1、3、5天等等。
给药方式可以是腹腔或鼠尾静脉。
注意，由于鼠尾静脉非常细，推药一定要非常慢。
药物的量一般根据裸鼠的体重进行调节。
当然，最重要的是药物的特性。
4、20-30天处死裸鼠，并进行相关数据的检测(肿瘤大小、重量等。
)。
注意时间点，可以经常观察，在最能体现你结果的时候将裸鼠处死。
备注：1、若对照组中20%小鼠的肿瘤小于400mg或平均重量小于1g，均为肿瘤生长不良，实验数据应作废。
因为裸鼠比较小，肿瘤生长相对缓慢，因此，时间可以调整以达到要求。
2、如对照组小白鼠肿瘤平均重量小于1g或20%鼠的瘤重小于400mg，大白鼠肿瘤平均重量小于2g，表示肿瘤生长不良。
3、在试验期间给受试物组鼠死亡超过20%，或平均体重(去瘤后)下降(自身对照)超过15%者，表示受试物的毒性反应。
应当减少剂量重新试验。
但是，肿瘤时间长可导致鼠恶病质，因此，肿瘤生长时间也不能太长，肿瘤不能太大。
否则无法判断时恶病质还是药物导致的毒性反应。
4、也可以不使用腹水瘤，直接用培养的细胞接种。
但是，细胞数一定要根据自己的需要。
一般来说，10*6即可使绝大部分裸鼠成瘤，但要想成瘤率高些，最好达到10*7细胞。
接种的时候一定要将细胞摇匀，否则肿瘤大小不一。
裸鼠前列腺原位肿瘤模型的建立作者：罗勇，张林琳，贺大林，李翔，宁亮，侯惠莲【关键词】，前列腺癌Establishment of prostate cancer model by orthotopic injection of human prostate cancer cell line Dul45【Abstract】 AIM: To establish a prostate cancer orthotopic injection model in nude mice and to discuss its value of application. METHODS: Lower abdominal incision was made in 10 male nude mice. After the bladder and prostate were exposed，Dul45 (6X106) wasinjected in ventral prostate lobes under the prostatic capsule by a TB syringe with a 29gauge needle at 50 f J t L per mouse. The abdominal wall and skin were then closed with 70 surgical suture and the vital signs of the nude mice were observed. When the mice were dying, they were sacrificed. After the mouse was killed, the tissues of prostate, bladder, lymphatic node, lung and liver were taken out, fixed in 40g/L formaldehyde, embedded in paraffin, stained by HE and then observed microscopically. The bone metastasis was observed by Xray. RESULTS: The incidence of primary tumor after intraprostatic injection was 60% (6 of 10) . About 14 d later, there were small palpable nodes in prostate and about 19 d later, cachexia occurred in nude mice. After dissection, it was shown that the diameter ofprimary tumors varied from 0. 8 cm to 1. 5 cm and the envelope of theliver became crimpy. Acute hepatitis could be observed undermicroscopy, which represented a large scale of hepatocyte death,liver sinus dilatation and hyperemia, hepatic lobule infiltrated by lymphocyte and macrophage and inconspicuous hyperplasia.CONCLUSION: The orthotopic injection model is an optimal animalmodel to study the occurrence and development of prostate cancer. Itmimics the natural situation of human prostate cancer and will helpto understand the mechanisms of androgenindependence and osseousmetastasis and tumorhost determinants of prostate specific antigen(PSA) expression.【Keywords】 prostate neoplasms; orthotopic injection; metastasis;nude mice【摘要】目的：建立一种裸鼠前列腺癌原位模型.方法：在10只裸鼠下腹部切口，显露膀胱和前列腺，用 1 mL 了8针筒、296针头在其前列腺左右腹侧叶包膜下接种人前列腺癌0以45细胞50 uL,共计6乂106个，以建立原位肿瘤模型，观察裸小鼠生命体征变化.于濒死状态下处死，并取原位肿瘤、膀胱、盆腔淋巴结、肺脏和肝脏标本，用40 8几甲醛固定、石蜡包埋和册染色后显微镜下观察，乂线照射显示骨骼转移情况.结果：10只裸鼠中有6只模型建立成功.接种后14 4左右，可触及前列腺部位有黄豆大小的包块，质硬.19(1后出现恶液质，解剖后发现前列腺部位有包块生长，直径约在0.8~ 1.5 cm,其中2例侵及膀胱.肝脏泛黄、被膜皱缩，镜下呈急性重型肝炎的病理改变.结论：小鼠前列腺原位移植瘤模型建立成功.【关键词】前列腺癌；原位注射；转移；裸鼠0引言前列腺癌初诊时大约30%〜50%的患者已发生转移[1]，而目前针对前列腺癌侵袭和转移的机制及有效的治疗措施研究较少，一个重要原因是缺乏合适的动物模型.为了建立一种更接近于人类肿瘤体内自然生长过程的前列腺癌动物模型，我们通过原位注射人前列腺癌细胞Dul45技术建立起BALB/c裸鼠的前列腺癌原位种植瘤模型如下.1材料和方法1.1材料雄性3人16/(；裸鼠10只，6砘龄，体质量20径左右，由第四军医大学实验动物中心提供.均在SPF条件下层流架内饲料饮水_由摄入.Dul45细胞系由美国Chung LW惠赠.用含100 mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的RPMI 1640培养液（美国0讣00公司）在371，50 mL/L 002的孵箱内培养，以1.25 g/L胰酶和0. 2 g/L EDTA的混合液消化传代.1.2方法裸鼠用10 8几戊巴比妥钠（75 mg/kg)麻醉，仰卧位，胶带固定四肢，下腹部正中横切口1 cm，暴露膀胱和精囊腺，用棉签轻压膀胱顶壁、腹侧壁，并向下游离至膀胱颈，推开肌肉及生殖腺进一步暴露前列腺，可见其大小约1.0 mmX1.5 mmX2.0 mm,分左右2叶，呈粉红色，有明显的腺体组织特征.用1 mL 了6针筒、296针头轻轻挑起一侧前列腺包膜，缓慢进针，直至顶起对侧包膜，明确针尖进入包膜后，再缓慢推注0“45细胞悬液50 UL (6X106个），以包膜向上鼓起，脱离腺体表面为满意标准.恢复脏器的解剖位置，用70可吸收线分别间断缝合腹壁肌肉层和皮肤层，待鼠苏醒后回笼.以裸鼠出现恶液质、处十濒死状态作为观察终点，颈椎脱0法处死.尸解并观察荷瘤部位肿瘤的生长情况.裸鼠处死后，立即在100 mA, 40 kV, 5.23 ms条件下行X线检查.裸鼠与球管距离为1.0 m;然后取前列腺、膀胱、盆腔淋巴结、肝脏和肺脏标本，40 §几甲醛固定、石蜡薄层切片4 um,册染色后光镜下观察有无转移灶.2结果2.1肿瘤模型的建立裸鼠注射后14 d可于下腹前列腺部触及结节，黄豆大小、表面光滑、质硬、活动度差.19 (1出现恶液质，解剖后发现6只裸鼠前列腺部位有包块形成，直径0.8~1.5 cm.病理证实原位移植瘤模型建立成功.2.2侵袭和转移前列腺部位包块呈结节状、质硬，与周围精囊腺、输精管、膀胱及肠管黏连.肝脏有明显的肉眼病变，体积缩小、颜色泛黄、表面被膜皱缩、遍布黄色斑点状病变.2只裸鼠前列腺原位肿瘤侵及膀胱（Fig 1)，病理检查未见肝、肺、盆腔淋巴结肿瘤转移灶；乂线也未发现骨骼病变.0.3HE染色结果前列腺组织内有成群密集的未分化上皮细胞，细胞排列紊乱，有丰富的、泡沫样的嗜酸细胞象，异形性明显，核大深染，核内有多形的、数目不均的染色质（Fig 2),有巨核细胞，间质成分少，瘤体中间无坏死，仅见极少腺样结构；肝脏呈急性重型肝炎表现，镜下可见：肝细胞弥漫性的大片坏死，以小叶中央最为明显，肝窦扩张充血，小叶内有淋巴细胞和巨噬细胞为主的炎性细胞浸润，小叶增生不明显.3讨论人前列腺癌动物模型是研究前列腺癌发病机制、肿瘤与宿主关系、癌肿侵袭与转移过程和治疗措施有效性不可缺少的理想实验工具，因此，建立理想的前列腺癌动物模型应能最大程度地模拟人类前列腺癌的发生过程并具备以下特点[2] :@人源性肿瘤，可分泌前列腺特异性抗原(?3八)；②肿瘤特性与人类前列腺癌相似；③对激素的治疗反应与人前列腺癌相似.裸鼠因其免疫缺陷特性成为建立人类肿瘤动物模型的最佳载体.以往制作前列腺癌裸鼠模型时多选择皮下作为荷瘤部位，接种方便、易于观察，但是根据？叫的[3]的“种子与土壤”（Seed and Soil)学说，肿瘤的生长和转移依赖于一个合适的微环境，因此原位种植较皮^卜接种具有更高的致瘤率和转移机率，且皮下移植瘤模型并不能很好地模拟前列腺癌在人体内的_然生长过程以及许多生物学行为，而原位种植不仅使肿瘤细胞获得了更接近人体内的生长微环境，而且其中丰富的内源性生长因子，能够提高移植成功率，并形成与临床相似的转移模式.8&10等[4]对比前列腺癌1?€&?细胞悬液分别作3010鼠皮下和原位种植后的情况，结果皮下组中100%成瘤，无一发生淋巴结及远处转移；原位组中89%成瘤，但全部发生腹膜后和纵隔淋巴结转移，40%发现有镜下肺转移.Rembrink等[5]和Wang等[6]用前列腺癌？03，PC31251L，13即1^和[?^&?细胞作裸鼠的原位种植模型，致瘤率高,淋巴结、肺部转移率极高.由于裸鼠前列腺非常小（约50 mg)，因此进行肿瘤细胞注射需要特别精细的操作.而且，注入肿瘤细胞后10〜180 min,即使没有直接刺入血管，也容易产生自发的淋巴道和血道转移而造成人为的播散.我们进行了多次预试验，最终达到了包膜向上鼓起，脱离腺体表面的要求[5]，最终成瘤率为60%，与国内王鹏飞等[7]的结果相似.我们还观察到，所有小鼠术后均发生急性重症肝炎，其性质可能是一种自身免疫性急性重症肝炎（AIH).目前六识的发病机制尚不清楚，但有研究表明药物、环境和病毒感染可能是六四的促发因素.由于小鼠过早出现肝衰竭，因此本组模型中未能观察到肺转移、淋巴结转移和骨转移.另外，种植组织学完整的瘤块比肿瘤细胞悬液的成瘤率和转移率更高[8]，但对显微器械和操作精细程度的要求更高.因此，原位注射肿瘤细胞逐渐成为当前的主流技术.此外，成熟的建模技术有助于“培育”出生物学特性更接近临床实际的新细胞株.例如，绝大多数前列腺癌细胞株不能分泌？34，不利于肿瘤模型的监测，11^#虽能分泌？34，却属于一种雄激素依赖型细胞株，限制了它在雄激素非依赖型前列腺癌中的研究应用.Thalmann等[9，10]利用1%#建立不同的免疫缺陷动物模型，培育了一系列亚细胞系，既保留了？5八的分泌特性，又对雄激素非依赖，恶性度更高.利用这些亚细胞系在裸鼠身上分别皮下和前列腺原位接种，均建立了较LNCaP细胞更具致瘤能力和骨转移潜能的动物模型.Harp e r等[ll]利用1£町2在不同条件下造模后，也成功地培育了两种新的细胞亚系TEN12F和TEN12C,为在分子水平解释人前列腺癌从雄激素依赖型向非依赖型转变的机制创造了条件.【参考文献】[1]Stamey TA, Mc Neal JE. Adenocarcinoma of the prostate [A]. In: Walsh PC, Reik AB, Stamey TA, et al. Campbells urology [M] . 6th ed. Philadelphia: WB. Saunders Company, 1992: 1185.[2] Bastide C, Bagnis C, Mannon P, et al. A Nod Scid Mousemodel to study human prostate cancer [J] . Prostate Cancer ProstaticDis, 2002； 5: 311-315.[3]Paget S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast [J] . Cancer Metastasis Rev, 1989； 8:98-101.[4]Sato N, Gleave ME, Bruchovsky N, et al. A metastasis and androgensensitive human prostate cancer model using intraprostatic inoculation of LNCaP cells in SCID mice [J] . Cancer Res, 1997； 57:1584-1589.[5]Rembrink K, Romijn JC, Van der kwast TH, et al. Orthotopic implantation of human prostate cancer cell lines: A clinicallyrelevant animal model for metastatic prostate cancer [J] . Prostate,1997； 31: 168-174.[6]Wang XE, An ZL, Geller J, et al. Highraalignancy orthotopic nude mouse model of human prostate cancer LNCaP [J] . Prostate, 1999 39: 182-186.[7]王鹏飞，师长宏，邵晨，等.利用裸鼠建立人前列腺肿瘤原位移植模型[J] •中华实验外科杂志，2002; 19(3): 230-231.Wang PF, Shi CH, Shao C， et aL Establishment of urogenitalinfinite tumor cell lines by nude mice tumor xenotransplantation [J]Acta Lab Anim Sci Sin, 2002; 19(3): 230-231.[8]Hoffman RM. 0rthotopic metastatic mouse models foranticancer drug discovery and evaluation: A bridge to the clinic[J] . Invest New Drug, 1999； 17: 343-359.[9]Thalmann GN, Anezinis PE j Chang SM, et aLAndrogenindependent cacer progression and bone metastasis in theLNCaP model of human prostate cancer [J] . Cancer Res, 1994; 54:2577-2581.[10]Thalmann GN, Sikes RA, Wu TT, et al. LNCaP progression model of human prostate cancer: Androgenindependence and osseous metastasis [J] . Prostate, 2000; 44: 91-103.[11]Harper ME, Goddard L，Smith C，et al. Characterization ofa transplantable hormoneresponsive human prostatic cancer xenograft TEN12 and its androgenresistant sublines [J] . Prostate, 2004; 58: 13-22.。
