⑵ 从RNA合成单链cDNA探针
用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种:
a. 寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用 于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏 向于mRNA 3‘末端序列。
b. 可用随机引物合成cDNA探针。该法可防止上 述缺陷,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA 中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列 往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到 的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可 被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析 即可得到单链探针。
切口平移法
(2)随机引物法
经过热变性使模板DNA 变为单链DNA,随机 引物与单链DNA退火后,利用Klenow Fragment合 成互补链。此时假设底物中dNTP的一种或几种被 [α-32P], [α-35S], [3H] 等标志时,那么合 成的互补链DNA也被标志。合成后的双链DNA经过 热变性变成单链后即可用作杂交探针。
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probe) 背景: 129I:0.7 cps (20-100 KeV) 灵敏度: 129I : 20 Bq in 10 min 分辨率: 129I : 2-3 mm(depending on the used