浙江大学生物化学甲实验课件 实验3 蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法

folin酚法测定蛋白质含量Folin-酚法是一种测定蛋白质含量的经典方法，其历史可以追溯到1948年。

此方法的基本原理是酚类物质在碱性条件下与蛋白质反应，生成一种深蓝色的复合物，该复合物在760nm处的吸光度与蛋白质浓度成正比，因此可以通过测定吸光度来计算蛋白质浓度。

以下是Folin-酚法测定蛋白质含量的详细步骤：一、实验准备1.实验材料：o待测样品（蛋白质溶液）o Na2CO3o NaHCO3o硫酸铜o酒石酸钾钠o氯仿o无水乙醇o磷酸二氢钾o氢氧化钠2.实验设备：o分光光度计o研钵或电动搅拌器o漏斗和滤纸o玻璃试管和试管架o移液管o搅拌棒二、实验步骤3.准备Folin-酚试剂：将10g的酒石酸钾钠与50g的Na2CO3、NaHCO3混合在研钵中，充分研磨后转移至烧杯中，加入80ml的蒸馏水，搅拌至溶解。

将溶液煮沸并保持1分钟，然后冷却至室温。

将混合物转移至1L容量瓶中，用蒸馏水定容至1L。

4.取1ml待测蛋白质溶液（约0.01-1mg蛋白质）加入到试管中。

5.向试管中加入5ml Folin-酚试剂，混匀。

6.将混合物在室温下保持30分钟，期间不时搅拌。

7.在760nm波长下，用分光光度计测定混合物的吸光度。

为了获得更准确的结果，可以以蒸馏水为空白对照调零。

8.根据标准曲线计算蛋白质浓度。

可以通过绘制已知蛋白质浓度与其对应的吸光度的曲线图来制作标准曲线。

根据待测样品的吸光度，可以在曲线上找到对应的蛋白质浓度。

9.根据需要，可以进一步计算蛋白质的含量（mg/mL或mg/g）。

三、注意事项和局限性1.Folin-酚法对碱性环境非常敏感，如果在试剂准备和混合过程中出现不慎或操作不当，可能会影响到最终的测定结果。

因此，操作者需要熟练和准确的掌握该方法的操作步骤。

2.本方法不适用于测定含有大量酚类物质或还原性物质的样品，这些物质可能会干扰蛋白质与Folin-酚试剂的反应，导致结果偏差。

3.一些蛋白质的氨基酸序列中含有酪氨酸或色氨酸残基，这些残基可以与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，导致吸光度偏高，最终结果可能偏高也可能偏低。

实验报告课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶活力测定及其分离纯化效果的评价同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛、袁平、朱耀仁、蔡玉林 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法①学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；②掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量； ③掌握分光光度计的使用方法。

2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法 ①掌握酶活力测定的基本原理和方法； ②学习酶的比活力的计算。

二、实验内容和原理1、Folin-酚测定法Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。

甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。

可用500nm 波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L 。

优点： 简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。

缺点： 该反应受多种因素的干扰。

2、蔗糖酶活力测定蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。

它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。

因此，每水解1mol 蔗糖，就能生成2mol 还原糖。

还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉试剂比色法，斐林试剂法等。

酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于植物和微生物体内，专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。

酵母蔗糖酶分子量约270000D，pI约5．0，最适pH4．6，耐酸和热，50℃保温30min 仍具有相当的活力，最适温度37℃。

耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。

二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提。

加热纯化。

乙醇分级沉淀。

纤维素柱层析分离纯化。

㈠、前三步分离纯化的原理如下：甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等取中层50水浴中使热不稳定蛋白变性上清：蔗糖酶、可溶性糖等（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等㈡、纤维素柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。

离子交换层析是一种液-固相层析技术。

其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。

在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE纤维素、强碱型的离子交换树脂等。

反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。

离子与交换剂的静电结合作用具如下特点：选择性：离子所带的电荷越多，离子半径越小，越易结合。

遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交换剂结合方向进行可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它）离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。

实验三：福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、实验目的1．学会制备无蛋白血滤液。

2．掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。

3．掌握7200型可见分光光度计的使用方法。

二,实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。

蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。

三.实验仪器1．试管2．移液管3．卵清蛋白片4．7220分光光度计四.实验试剂1、碱性硫酸铜溶液A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。

临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。

2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。

(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。

3、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。

4、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。

五.实验步骤1、无蛋白血滤液的制备：用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。

再加0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴）。

用干滤纸过滤。

先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。

每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。

2、血糖的定量测定：取25ml的血糖管3支，编号。

第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。

Folin-酚试剂法测蛋⽩质含量实验1-3 蛋⽩质的定量测定（Folin-酚试剂法）⼀、实验原理1921年，Folin ⾸创Folin-酚试剂法，利⽤蛋⽩质分⼦中酪氨酸和⾊氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝⾊反应；1951年，Lowry对此法进⾏了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提⾼了灵敏度。

Folin-酚试剂法主要包括两步：第⼀步双缩脲反应在碱性溶液中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与Cu2+作⽤,形成紫⾊或紫红⾊的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。

由于蛋⽩质分⼦中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。

即在碱性溶液中，蛋⽩质分⼦中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作⽤⽣成紫红⾊的蛋⽩质- Cu2+复合物。

第⼆步Folin-酚显⾊反应Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原⽽呈蓝⾊反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。

由于蛋⽩质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显⾊反应。

即蛋⽩质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或⾊氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，⽣成蓝⾊的化合物。

在⼀定浓度范围内，蓝⾊的深浅度与蛋⽩质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋⽩质标准液⽐⾊即可求出样品中蛋⽩质的含量。

另外，可以根据预先绘制的标准曲线求出待测样品中蛋⽩质的含量。

⼆、实验材料（⼀）样品健康⼈⾎清（稀释300倍）（⼆）试剂1．⽜⾎清⽩蛋⽩标准液（200 g/ml）准确称取⽜⾎清⽩蛋⽩粉末50.0mg，⽤0.1mol/L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏⽔到250ml。

2．碱性硫酸铜溶液①碱溶液：Na2CO3 2g 溶于100ml 0.1mol/L NaOH中。

②硫酸铜溶液：CuSO4?5H2O 0.5g溶于100ml 35mmol/L(1%)酒⽯酸钾钠中。

使⽤前将①与②按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液。

使⽤时新鲜配制。

3．Folin-酚试剂在2L磨⼝回流装置内加钨酸钠（Na2WO4?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g，蒸馏⽔700ml，14.68mol/L（85%）磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后⽤⼩⽕回流10h。

实验报告综合试验(三Folin-酚法测定蛋白质含量2010年 6 月3日摘要:本实验包括两个步骤,第一个步骤为制作标准曲线,第二个步骤为制备样品(牛奶和酪蛋白粗制品并用Folin —酚法进行蛋白质含量的测定,得到酶原液蛋白含量为8923 (ug/ml;洗脱峰Ⅰ蛋白含量82.692(ug/ml;洗脱峰Ⅱ蛋白含量121.923(ug/ml; 洗脱峰Ⅲ蛋白含量83.077(ug/ml。

此次实验与理论值仍存着一定的偏差。

通过本次实验的操作以及对实验结果的分析,了解Folin —酚法准确测定蛋白含量的原理方法,以及其相关的影响因素。

一、实验目的:1、测定实验中原液和洗脱液中蛋白质的含量2、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。

3、熟悉分光光度计的操作。

二、理论背景:Folin-酚试剂法包括两步反应:第一步是在碱性条件下, 蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物; 第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin 试剂还原, 产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物,颜色深浅与蛋白质含量成正比。

此法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100 倍,定量范围为5~100μg蛋白质。

Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起, 因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。

此外, 不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

三、实验装置:1. 实验材料原液, 洗脱峰2. 仪器(1移液管(0.5mL 、1mL 、5mL (2量筒(3 分光光度计(4 移液管、移液枪3. 试剂(纯度均为分析纯(1 0. 5mol/L NaOH(2 试剂甲:(A 称取10g Na2CO 3, 2g NaOH和0.25g 酒石酸钾钠,溶解后用蒸馏水定容至500mL 。

(B 称取0.5g CuSO 45·H 2O ,溶解后用蒸馏水定容至100mL 。

每次使用前将(A 液50份与(B 液1份,即为试剂甲,其有效期为1d ,过期失效。

Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量实验目的掌握Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量的原理、操作技术掌握制作标准曲线的要领，并通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量。

提高在严格时间限定下的实验操作能力。

二、实验原理蛋白质分子中酪氨酸可以和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸- 磷钼酸）起蓝色反应，此法由folin 在1921 年开创。

1951年，Lowry 对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。

第一步：双缩脲反应在碱性溶液中,双缩脲（H2NOC－NH－CONH2能）与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物。

即在碱性溶液中，蛋白质分子中的具有双缩脲结构的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+ 作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

第二步：Folin- 酚显色反应Folin- 酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐- 磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。

蛋白质- Cu2+复合物中所含的带酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比较即可求出样品中蛋白质的含量。

三、实验材料（一）样品健康人血清（300倍稀释，正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L ）（二）试剂牛血清白蛋白标准液（200μg/ml ），碱性硫酸铜溶液，Folin- 酚试剂（三）仪器与器材V-1100分光光度计，恒温水浴箱，移液管（2mL），洗耳球，试管6 支，试管架，加样枪，加样枪架四、实验步骤（一）操作步骤见表1-1表1-1 folin- 酚试剂法定量蛋白质实验步骤重复测三次，求平均值用于绘制标准曲线。

二）注意事项1.操作控制：folin- 酚试剂加到碱性铜- 蛋白质溶液中后，必须立即混匀，使还原反应发生在磷钼酸- 磷钨酸被破坏之前2.时间控制：因反应显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。

对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究兰德新（同组：李建鑫）浙江工业大学海洋学院食工1201摘要：目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。

方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。

结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。

为我们将来的实验奠定了技术上的基础。

关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE文献综述:蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。

因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。

而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。

在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性测定方法，而且也测定了该酶的部分性质及其在植物体内的时空分布。