多肽的分离纯化技术研究进展

多肽物质分离与分析方法研究进展赵锐顾谦群管华诗摘要综述了近几年来多肽类物质的提取分离与分析方法，主要包括高效液相色谱法、电泳、质谱及核磁共振等方法在肽类物质研究中的最新应用进展。

多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物学活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。

生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。

随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。

一些新方法、新思路的应用，不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。

本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。

1 分离方法采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。

对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等［1］。

这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、电泳等。

1.1 高效液相色谱（HPLC）HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其他化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。

因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。

如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。

1.1.1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。

为了获得一系列的保留系数，Wilce等［2］利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系，其中极性氨基酸残基在2～20氨基酸组成的肽中，可减少在柱上的保留时间；在10～60氨基酸组成的肽中，非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间。

生物活性多肽和多糖的分离纯化及其作用研究生物活性多肽和多糖是当前研究热点，多肽和多糖作为一类重要的生物活性物质，在医学、保健、食品等领域具有广泛的应用前景。

多肽和多糖的分离纯化及其作用研究对人类健康、环境保护和经济发展具有重要意义。

本文主要介绍多肽和多糖的分离纯化方法和作用研究进展。

一、多肽和多糖的特点多肽是由氨基酸组成的，相对分子量一般小于10000的生物大分子，具有生物活性。

多糖是一种高分子物质，由不同的单糖分子经糖苷键连接而成，常见的多糖有纤维素、壳聚糖、海藻酸等。

多肽和多糖具有广泛的作用机制，能刺激免疫系统、促进生长发育、改善血糖、血脂等生理指标，同时还具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性。

二、多肽和多糖的分离纯化方法1、超滤技术超滤技术利用过滤膜的分子筛选性，将大分子物质和小分子物质分离。

多肽和多糖多数具有分子量较小、分子量分布较窄的特点，适合采用超滤技术进行分离纯化。

超滤膜孔径大小和分离范围不同，选择适当的超滤膜孔径可以得到目标分子的高纯度分离物。

2、离子交换技术离子交换技术是利用离子交换基团将物质从混合溶液中选择性地吸附出来。

多肽和多糖具有不同的电荷性质，可以采用离子交换技术进行分离纯化。

根据目标物质的电荷性质和离子交换基团的性质选择适当的离子交换柱，可获得较高纯度的目标分子。

3、凝胶过滤技术凝胶过滤技术是利用不同孔径的凝胶微球分子筛选效应将不同分子量的物质分离开来。

多肽和多糖多为水溶性物质，适合采用凝胶过滤技术进行分离纯化。

选择适当的凝胶微球孔径和包涵量，可得到目标分子的高纯度分离物。

三、多肽和多糖的作用研究1、多肽的作用多肽在人体内具有多种生物活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降糖降脂等作用。

多肽医药涉及多种领域，如肿瘤、免疫、神经、内分泌、循环等。

多肽药物的研究涉及多个环节，如分离纯化、组合设计、药物动力学、药效评价等。

2、多糖的作用多糖在人体内具有多种生物作用，如抗氧化、免疫调节、抗菌、降压等。

生物活性多肽的分离纯化与生理功能研究生物活性多肽是一种蛋白质，具有生物调节活性，对于细胞和生理过程具有重要的调节作用。

因为其分子量小，其分离纯化较普通蛋白更为困难。

但是，通过现代分离纯化技术和分析技术，如高效液相层析法、逆流层析法、凝胶电泳法和基质辅助激光解析质谱法，近年来其分离纯化的技术水平已经得到了很大提高。

同时，研究人员也在探索其生理功能的更多方面。

1.多肽的分离纯化多肽的分离纯化技术繁多。

在高效液相层析法中，通常采用对分离相的选择来增加目标物与其他物质之间的差异性，并通过改变区带的pH值链接多肽与分离相的亲和力。

逆流层析法与前者类似，其通过逆向介质流动，有效地将样品分解成多个分离相，从而实现纯化。

其技术具有易于操作、高分离效率、可重复性好的特点，因而广泛地应用于多肽的分离纯化中。

凝胶电泳法通过利用多肽的电荷特性、分子大小、分子形状的不同等因素，将其分离开来，并识别出目标多肽的特异带。

这种方法可以实现高分辨率的分离，但是操作复杂，通常取决于实验操作人员的经验和技巧。

基质辅助激光解析质谱法在多肽纯化中的应用非常广泛。

通过在基质上涂覆样品，激光就会产生大量小分子离子，并的识别出各种有机物质。

该技术因其分离效率高、分析速度快、分析范围广泛等特点，使分析成为现代生命科学产生了革命性的变化。

2.多肽的生理功能研究多肽在人体内的生理机能非常重要。

什么是生理活性呢？常见的有紧张素、胰岛素、生长激素释放激素等。

在健康的身体中，这些多肽会更好地调节某些生理过程，例如血压、血糖水平等，与我们的身体储存和代谢有关，因此对多肽的生理功能研究引起了研究人员的高度关注。

在对多肽的生理功能研究中，研究人员借助了生理学、医学和化学等相关领域的知识，从而得到了多方面的研究进展。

例如通过细胞培养和动物模型技术，研究人员发现，多肽在规律化人体内某些生理过程的过程中，具有非常重要的功能；另外，各种基因工程技术也被应用于多肽的功能研究。

反相液相色谱应用多肽分离纯化与制备的研究进展发布时间：2021-09-01T15:19:07.077Z 来源：《医师在线》2021年18期作者：郑岳平黄振福冯春华[导读] 反相液相色谱这种色谱分离模式，以疏水作用为检测基础，重复性高，因高分辨率及回收率在多肽分离纯化及制备中得到了广泛应用郑岳平黄振福冯春华海南中和药业股份有限公司海南海口571800摘要：反相液相色谱这种色谱分离模式，以疏水作用为检测基础，重复性高，因高分辨率及回收率在多肽分离纯化及制备中得到了广泛应用。

本文主要就反相液相色谱分离原理及其在多肽分离纯化、肽图分析等领域中的应用进行综述。

关键词：反相液相色谱；多肽；分离纯化、制备随生物技术发展，多肽类药物因抗菌、抗氧化、抗癌、抗高血压等特性在生物制药还有功能性食品等领域得到了广泛性应用。

但多肽在固相合成下因体系复杂、副反应多，多肽纯度较低。

反相液相色谱利用物质疏水特性差异及高分辨率在多肽及蛋白质等物质分离纯化中得到了广泛应用。

1 反相液相色谱分离原理反相液相色谱固定相色谱主要为离子交换、氧化铝、硅胶等极性介质，固定相极性大于流动相。

固定相载体具有疏水性，被分离物质按疏水性不同在反相液相色谱中发生作用，使得不同疏水性质分子在反相柱中被先后分离。

疏水性弱的流出较快，疏水性强的则流出较慢。

同其他色谱法对比，反相液相色谱操作简单、重复性好，具有分辨率高及回收率高的优势。

分离纯化中国无需脱盐，操作步骤被大大简化，且蛋白质分析在色谱柱内会发生去折叠，内部疏水残基同固定相发生作用，提供更多信息，这一特性使反相液相色谱成为了多肽及蛋白质的一个主要分离模式。

2 反相液相色谱在多肽分离纯化与制备中的应用多肽是蛋白质内有20种氨基酸按照不同排列方式以肽键连接而形成的一类化合物的总称。

因组成肽的氨基酸种类多，且残基数量、种类不同，因此肽具有多样性这一特性。

肽有双缩脲显色反应，强碱条件时与Cu2+反应会形成紫色的络合物。

HPLC在合成多肽分离与纯化中的应用杜雾晨摘要：固相肽合成（SPPS）技术是目前制备各种模式多肽和天然多肽类似物的最有效方法，但是最终产物的成分往往比较复杂，不经纯化难以用于蛋白质多肽的结构、功能和药理学研究。

近年来已出现了多种多肽及蛋白质的分离纯化技术，高效液相色谱法（HPLC）是目前分析纯化合成多肽的主要手段。

本文根据固相肽合成方法的原理及产物特点，对高效液相色谱法在分析纯化合成肽中的应用作了较为系统的评述。

关键词：固相肽合成；纯化；高效液相色谱法多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。

多肽是构成蛋白质的结构片段,也是蛋白质发挥作用的活性基团,是人体进行代谢、调控活动的重要物质。

蛋白质主要以多肽形式吸收,透过多肽既可深入研究蛋白质的性质,又为改变和合成新的蛋白质提供了基础材料。

研究多肽结构与功能的关系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便应用中设计尽可能短的多肽同时提高其生理活性,减少临床的不良反应。

多肽类药物在临床上显示了巨大的应用价值,受到药物化学家越来越多的重视,多肽药物的研究和开发成为国际新药技术领域竞争中的重要方面。

化学合成的肽产品是一个纯度不好的粗产品,其一是因为在合成肽过程中各种副反应、消旋化等造成的副反应肽,二是在脱保护过程中,由于保护基的残留,肽键的断裂、烷基化等造成的杂质。

杂质的分子结构与合成肽很相似,或许二者之间仅仅在某一个位置的氨基酸残基不同,或许二者之间的差异仅仅在某一氨基酸残基侧链上某一基团是否存在等等。

由于杂质与合成的肽在分子结构和化学性质上如此相似,就给肽的分离纯化带来了困难[1]。

因此,根据对目的肽的要求,需要选择适当的方法进行纯化。

高效液相色谱(HPLC)是生物技术中分离纯化的重要方法,在多肽、蛋白质的分离纯化工艺中显示出优异的性能。

而且,它已走出实验室投入到大规模的工业化生产中,成为生物技术X围内一有力高效的分离工具[2]。

多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。

生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。

随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。

一些新方法、新思路的应用。

不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。

本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。

1 分离方法采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。

对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。

这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、电泳等。

1.1 高效液相色谱（HPLC）HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC 应用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。

因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。

如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。

1．1．1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。

为了获得一系列的保留系数，Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系，其中极性氨基酸残基在2～20氨基酸组成的肽中，可减少在柱上的保留时间；在10～60氨基酸组成的肽中，非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间，而含5～25个氨基酸的小肽中，非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。

多肽药物质量控制和研究方法的发展随着生物技术的不断发展，越来越多的多肽药物进入市场。

这些药物是由氨基酸组成的小分子，具有很高的生物活性和选择性，被广泛应用于治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病等多种疾病。

然而，多肽药物的制备和品质控制非常复杂，需要用到高效的分离、纯化和检测技术才能保证其质量和稳定性。

多肽药物的制备多肽药物的制备通常采用化学合成和生物发酵两种技术。

其中，化学合成是在液相或固相条件下，通过连接不同的氨基酸来制备多肽。

这种方法可以控制氨基酸的比例和结构，从而使合成的多肽药物满足特定的生物活性和选择性。

但是，这种方法需要用到复杂的化学品和反应条件，产生的副产物会降低多肽药物的质量和稳定性。

生物发酵是一种通过基因工程将表达目标多肽的基因导入到大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等微生物或真核细胞中，然后利用宿主细胞的生物代谢过程，在大量生产多肽药物的过程中纯化和分离目标多肽药物。

这种方法很大程度上减少了多肽药物制备中的副产物和污染物，从而提高了多肽药物的质量和稳定性。

多肽药物的质量控制多肽药物的质量控制是确保多肽药物在市场上具有一致性和稳定性的重要环节。

多肽药物的质量控制需要控制其结构、活性、纯度、溶解性、稳定性等多个方面。

常用的质量控制方法包括以下几个方面。

一、质谱技术质谱技术是目前多肽药物质量控制中最为普遍和有效的技术之一。

质谱技术可以通过重复的质量和序列鉴定，确保多肽药物的结构和序列一致性。

质谱技术可以用于检测多肽药物的副产物、杂质、重组蛋白等，从而提高多肽药物的质量。

二、高效液相色谱技术高效液相色谱技术是一种分离、分析和检测多肽药物的有效方法。

高效液相色谱技术可以用于分离多肽药物的映射、鉴定相关化学物质的溶解性和稳定性。

常用的高效液相色谱技术包括反相色谱、离子对色谱、尺寸排除色谱等。

三、核磁共振技术核磁共振技术是一种非常重要的质量控制技术，可以用于检测多肽药物的结构和形象。

核磁共振技术可以定量测定多肽药物的结构和光学异构体的含量。

多肽纯化分离方法和发展方向
多肽的浓度较低，成分复杂，尤其是杂质的理化性质和目标多肽十分相似，分离纯化比较困难。

虽然多肽纯化的方法繁多，但由于多肽大多数具有相似性，使用目前的纯化分离方法已经达不到理想的分离效果，而且都或多或少存在一定的弊端。

多肽纯化分离方法将朝着以下几个方面发展：
①根据多肽的种类和性质不同，组建多肽分离纯化方法数据库(包括:色谱、层析、电泳等方法)，收集多肽图谱，制作多肽分离纯化的预测软件，利于今后的分离纯化和对比分析;
②可选用载体先将目标多肽与载体结合转化为易分离的物质，分离出目标多肽后，再去掉载体获得多肽纯品;
③利用多种方法联用技术已显示出巨大的优越性。

特别是近年来，采用将多种技术联用分离纯化多肽取得一定进展。

德兰梅勒利用膜分离技术为生物制药、食品饮料、发酵行业、农产品深加工、植物提取、石油石化、环保水处理、空气除尘、化工等行业提供分离、纯化、浓缩的综合解决方案，满足不同客户的高度差异化需求。

帮助客户进行生产工艺的上下游技术整合与创新，帮助企业节省投资、降低运行费用、减少单位消耗、提供产品质量、清洁生产环境，助力企业产业升级。

反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备作者：闫凤来源：《科学与财富》2017年第35期摘要：随着现代生物技术的发展，出现了各种多肽类药物，多肽在临床医学中有巨大的应用价值。

用反相高效液相色谱（RPLC）对两种化学合成多肽-32肽和21肽进行了分离、纯化和制备，能够提高多肽的纯度。

基于此，文章主要对多肽反相液相色谱法的分离、纯化与制备进行了简单的分析与研究。

关键词：多肽；反相液相；分离、纯化、制备引言多肽是氨基酸以肽链连接形成的化合物，其多肽在临床医学中有着较高的应用价值。

在现代化生物技术的影响下，多肽化学合成技术水平也在不断提升，但是，由于多肽化学合成的产物成分比较复杂，对其混合物进行分离提纯优化就显得格外重要。

只有对多肽化学产物进行分离提纯，才能提高多肽产物的纯度，保证多肽的药用价值。

1反相液相色谱法概述反相液相色谱法是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种，该方法具有柱效高、分离能力强、保留机理清楚等优点，对于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析，反相液相色谱正受到越来越多的关注。

在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度，取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数，组分在固定相上的保留时间越长，固定相与流动相之间的极性差值越大。

而流动相为极性，固定相为非极性的液相色谱就是反相液相色谱。

2多肽反相液相色谱实验分析2.1实验仪器与试剂选择第一，实验仪器。

选用型号为SCL-10AVP液相色谱仪，该色谱仪包括系统控制器、LC-10ATVP色谱泵、进样阀、SPD-M10AVP二极管阵列检测器、CLASS-VP5.33色谱工作站。

色谱柱为200×4mmID的不锈钢管，用匀浆法装填德国进口Nucleosil4000-7C18反相色谱填料。

KQ-250型超声波清洗器、TLL-C台式冷冻离心机、E-Pure纯水器。

第二，试剂。

试剂选择色谱纯乙腈、三氟乙酸（TFA）、32肽、21肽粗品。

2.2实验方法将合成多肽粗品用含乙腈水溶液溶解后，离心，保留上清液，弃去沉淀。

天麻多肽的分离纯化研究董转年,龚秀会,彭波,刘小烛3(西南林学院,云南昆明650224)摘要:目的:研究生物多肽对生物机体的生命活动有益或生理作用。

方法:对天麻(Gastrodiae elata B1.)初提液两次超滤(3kDa 和1kDa 超滤膜),凝胶过滤和快速蛋白液相色谱(FP LC )分离纯化,以及反相高效液相色谱(RP -HP LC )对目标肽进行分析检测。

结果:由Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱层析分析肽液,得到各肽组分的相对分子质量分布范围。

FP LC 和RP -HP LC 分析第二峰结果表明,此多肽组分分别只由一种肽组成。

结论:此多肽相对分子质量在2500Da 左右,具有很好的亲水性。

关键词:天麻;活性肽;凝胶过滤;FP LC ;分离纯化;RP -HP LC中图分类号:Q514+.3 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2007)06-0056-03R esearch of Purification the Peptides from Gastrodiae elata B 1.DONG Zhuan -nian ,G ONG X iu -hui ,PE NG Bo ,LI U X iao -zhu3(S outhwest F oresty C ollege ,K unming 650224,China )Abstract :Peptides has played useful or physical role on the organism.A fter tw o ultrafiltrations (3kDa and 1kDa )of Gastrodiae elata B1.,the pu 2rification G el filtration and fast protein liquid chromatography (FP LC ),and the target peptides analysis Detection using RP -HP LC.And further determination of its m olecular weight and amino acid composition.The results showed that ,By Sephadex G-15sephadex column chromatography analysis of peptides ,obtained the distributions of every m olecular weight.And the results from FP LC and RP -HP LC of the second peak showed that it was composed only by one peptide.Its m olecular weight is about 2500Da ,with g ood hydrophilic.K ey w ords :Gastrodiae elata B1.;G el filtration ;FP LC ;Purification ;RP -HP LC收稿日期:2007-09-21;修回日期:2007-10-13基金项目:科技部重大基础研究专项资助(“天麻药理研究”,2004CCA01900);西南林学院创新基金项目资助(200607)作者简介:董转年(1982-),女,硕士,研究方向:林木细胞与分子生物技术,E -mail :linli19822003@ ;3通讯作者。