发酵工程菌种保藏

五.简答题1.菌种保藏的原理与方法？答：菌种保藏的方法很多，其基本原理都是根据微生物的生理生化特性，人为的创造条件，是微生物处于代谢不活跃(泼)，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。

一般可以通过降低培养基营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。

常用菌种保藏方法有①斜面冰箱保藏法；②沙土管保藏法；③石蜡油封保藏法；④真空干燥冷冻保藏法；⑤液氮超低温保藏法⑥低温冷冻保藏。

2.培养基成分选择要考虑的问题？答：（1）菌体的同化能力（2）代谢的阻遏和诱导，（3）合适的碳氮比，（4）pH的要求。

3.培养基营养成分包括那几类？答：培养基的成分包括：能源物质、 碳源物质、氮源物质、无机盐、微量元素、特殊生长因子、前体、促进剂和抑制剂、水分。

4.发酵培养基由哪些成份组成？答：（1）碳源 构成菌体和产物的碳架及能量来源（2）氮源 构成微生物细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质（3）无机盐和微量元素（4）生长因子：微生物生长不可缺少而细胞自身不能合成的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

（5）水、产物形成的诱导物、前体和促进剂5.简述培养基的类型有哪些？答：培养基的类型有很多，按照组成成分，有合成培养基和天然培养基，按照培养基的状态，可以分为固体，液体和半固体培养基，也可以按照用途分为孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。

6.什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？（分类依据发酵类型可分哪几类？）答：根据产物形成与底物利用的关系，即碳源利用与产物形成速度的关系，将微生物发酵过程分成以下三个类型：第Ⅰ型（又称为与生长相关型）、第Ⅱ型（又称为与生长部分相关型）、第Ⅲ型（又称为与生长不相关型）。

一类发酵：产物形成与底物利用直接相关，为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来,产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化是平行的，产物生成与微生物的生长也是平行的。

微生物工程4--菌种保藏原理和方法微生物工程4--菌种保藏原理和方法一、菌种保藏的意义---菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。

所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。

其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。

二、菌种的衰退和复壮-----菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象称为菌种衰退。

1.菌种衰退的原因:菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。

所谓负突变是指生产菌株的生产性状下降的突变2.防止菌种衰退的方法有①控制传代次数②选择合适的培养条件③利用不同类型的细胞进行传代④选择合适的保藏方法1.斜面低温保藏法：将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，待菌种充分生长后，便可放在4℃左右的冰箱中进行保藏。

细菌、酵母菌、放线菌和霉菌都可使用这种保藏方法。

保存期为3-6个月。

原理：低温下微生物代谢慢②砂土管保藏法：适合于产孢子或芽胞的微生物。

一般保存期为2年左右，有的可达十～几十年。

沙、土洗净，烘干，过筛，按1-2：1混匀，分装小试管中，高度1cm左右，121℃高压蒸汽灭菌2-3次，烘干，检验无菌备用。

ν试管中加入菌悬液或孢子，干燥，真空封口即可。

原理：干燥，寡营养③真空冷冻干燥保藏法：加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。

适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。

原理：干燥，低温。

④液氮保藏法：将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196℃）。

适用于各种微生物的较理想的保藏方法。

对一些不产孢子的菌丝体用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。

其保存期最长。

原理：低温⑤悬液保藏法（寡营养保藏）：将微生物悬浮在不含养分的溶液中，如水、缓冲液、生理盐水，室温保藏，一般为一年。

发酵菌种：菌种建库流程及管理安全性问题1. 菌种建库流程1.1菌种筛选菌种筛选是微生物菌种建库的第一步，其目的是从自然环境、生物体或实验室保存的菌种中，筛选出具有特定生理生化特征或能够合成特定代谢产物的菌株。

这一过程包括样品采集、菌种分离、初筛和复筛等环节。

1. 样品采集：从目标环境（如土壤、水、空气）或目标生物体（如植物、动物）中采集样品。

2. 菌种分离：将采集的样品经过适当的处理（如稀释、培养、纯化），分离得到单一菌株。

3. 初筛：通过生理生化实验，对分离得到的菌株进行初步筛选，以选择具有特定特征的菌株。

4. 复筛：对初筛中具有特定特征的菌株进行进一步的筛选，以确定最佳菌株。

1.2菌种鉴定在筛选出具有特定特征的菌株后，需要对菌种进行鉴定，以确定其分类学地位和生物学特性。

菌种鉴定主要包括形态学鉴定、生理生化鉴定和分子生物学鉴定等方法。

1. 形态学鉴定：观察菌株的形态、大小、结构、染色等特征，以确定其分类学地位。

2. 生理生化鉴定：对菌株进行一系列生理生化实验，如对碳源、氮源的利用，pH、温度等生长条件的适应性，以及代谢产物等的分析，以了解其生物学特性。

3. 分子生物学鉴定：通过基因序列测定、多态性分析等方法，对菌株进行分子水平的鉴定，以更准确地区分不同微生物物种。

1.3基因组测序基因组测序是微生物菌种建库的重要环节，其目的是获得菌株的全部基因组序列，从而为后续的基因组分析提供基础数据。

基因组测序一般采用第二代测序技术（如Illumina HiSeq、MiSeq等）或第三代测序技术（如PacBio RS II等）。

1. 基因组提取：从菌株中提取高质量的基因组DNA。

2. 测序建库：将基因组DNA构建成适合测序的文库。

3. 测序：将文库上机进行高通量测序。

4. 质控：对测序得到的原始数据进行质量控制，去除低质量序列和噪声。

5. 拼接：将高质量的序列拼接成完整的基因组序列。

1.4数据库构建数据库是微生物菌种建库的核心部分，其目的是将菌株的基因组数据存储起来，以便后续的数据分析和挖掘。

菌种保藏方法_菌种应该怎么保存引导语：菌种应该怎么保存呢?以下是小编收集整理的关于菌种保藏方法相关内容，欢迎阅读参考!菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。

传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如*奶等常用生产菌种的保存。

传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。

培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。

若为产*菌种，则应在培养基中添加少量碳*钙。

一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。

传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传*状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原*、形成生理活*物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。

2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。

此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。

其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳*杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。

3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。

常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。

方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。

保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。

使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)，置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。

实验室菌种保藏的方法菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。

一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。

因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。

各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。

一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。

下面介绍几种常用的菌种保藏方法：1斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4。

C左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。

此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。

放线菌、霉菌和有芽匏的细菌一般可保存6个月左右，无芽抱的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。

如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4。

C冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。

这一改进可使菌种的保藏期延长。

此法由于采用低温保藏，大大减缓了微生物的代谢繁殖速度，降低突变频率；同时也减少了培养基的水分蒸发，使其不至于干裂。

该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。

其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。

2石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端IC明使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4。

C冰箱内保藏。

使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150〜170。

C烘箱内灭菌Ih;或121。

C高压蒸汽灭菌60〜80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。

发酵工程实验指导书（2014版）宁波大学海洋学院2014.09发酵工程实验指导书目录实验一乳酸菌的分离与初步筛选实验实验二乳酸菌的初步鉴定实验实验三乳酸菌菌种保藏实验实验四乳酸菌的培养与发酵实验实验五乳酸菌发酵产物的分析与测定实验六发酵罐操作训练发酵工程实验指导书（2014版）３实验一 乳酸菌的分离与初步筛选实验一、 实验目的及要求1、 掌握从环境样品中分离所需微生物的一般操作2、 掌握平板划线分离菌种的原理和操作方法3、 掌握利用透明圈法获得单菌落菌株的原理。

二、 实验原理自然样品中存在混杂的微生物，通过选择性培养基及样品稀释使形成细胞分散液，再通过固体培养基在合适的培养条件下培养形成单菌落，由此得到分离的纯培养菌株。

乳酸菌最基本的代谢特性是发酵产酸，待分离样品在合适的培养基和培养条件下，乳酸菌在特定设计的培养基中由于生长产酸产生溶钙形象，从而在培养基中产生透明圈，透明圈直径大小可反映菌落生长产酸量的大小，而不是乳酸菌或不产生酸积累的细菌不能产生透明圈。

三、 实验器材1、 待用分离样品（腌菜，各种泡菜，酸奶，植物汁液，等）；2、 培养基：MRS 培养基或改良乳酸菌分离培养基；无菌水；3、 器皿与设备：培养皿、移液管、试管、三角瓶、接种环、涂布棒、超净工作台、天平、采样瓶，培养箱，等。

四、 方法和步骤 1、 分离样品的采集 采样须知：结合乳酸菌菌种特性（文献资料查阅），获取乳酸菌在自然界或相关产品等的分布规律，设计样品采集范围。

采集样品经适当保存或立即处理。

2、 菌种的分离称取样品5g 或5ml →加到45ml 无菌水的三角瓶中（30℃恒温处理20分为佳）→充分震荡后（含玻璃珠）使其自然沉淀→用1ml 移液管吸取上清菌悬液1ml 至9ml 无菌水试管中→依次进行10倍稀释至10-4~10-5→用移液管吸取1mL 菌悬液至含碳酸钙的MRS 培养基平板中，涂布均匀→30℃恒温培养2~3天→观察菌落，分别挑取生长良好的含透明圈的可疑乳酸菌单菌落，分别移接至普通乳酸菌培养基的斜面试管，菌种编号，30℃恒温培养1~2天，长菌后在4℃冰箱保存待用。

菌种的保藏
菌种保藏的措施
斜面传代保藏方法
是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养逐上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。

它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。

但此方法易发生培养基于枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。

因此，要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。

斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。

此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3～6个月。

例如，放线菌于4～6℃保存，每3个月移接1次；酵母菌于4～6℃保存，每4～6个月移接1次；霉菌于4～6℃保存，每6个月移接1次。

菌种保藏（culture preservation）首先挑选典型优良纯种，其次创造一个有利于休眠的环境条件，还要考虑方法的通用性与简便性。

1、低温保藏：冰箱、超低温。

2、干燥保藏：土壤、细砂、硅胶等。

3、隔绝空气保藏：石蜡油封。

4、冻干保藏：综合低温、干燥、真空。

5、活体保藏：病原微生物、病毒。

实验室常用方法：1、斜面冰箱保藏法：斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。

一般保存期为三个月到六个月菌丝速冻法：对于不产孢子或芽孢的微生物，一般不能用沙土管保藏。

为了方便可以采用甘油菌丝速冻法。

由于该法的保藏温度为-20℃，为了避免微生物受损伤致死，需要甘油作为保护剂。

甘油的最终浓度为25%。

2 、沙土管保藏法：适合于产孢子或芽孢的微生物。

将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。

一般保存期为1 年左右。

3、石蜡油封存法：向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。

此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。

保存期约一年左右。

4、真空冷冻干燥保藏法：目前常用的较理想的一种方法。

在真空中使水分升华。

微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。

菌种保存时间一般５年左右。

需要一定的设备。

保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。

保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。

保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。

5、液氮超低温保藏法：适用范围最广的微生物保藏法。

尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。

原理：用液氮能长期保存菌种。

这是因为液氮的温度可达-196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度(－130℃)，所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。

菌种保藏的要点
菌种保藏的要点包括以下几点：
1. 菌种的分离与培养：选择合适的方法将所需菌种从样品中分离出来，并进行适当的培养，确保纯净度和菌株的健康状态。

2. 菌种的保存介质：选择适合菌种保存的介质，常见的包括琼脂、液体培养基、冰冻保存液等。

保存介质要符合菌株生长的需求，并具备较长的保存时间。

3. 冷冻保存：将菌种培养物经过适当处理后保存在低温环境中，常见的冷冻方式包括冷冻干燥、液氮冷冻等。

冷冻保存可以有效地延长菌株的保存时间。

4. 恒温保存：将菌种培养物保存在稳定恒温环境中，如恒温培养箱或恒温冰箱。

保存温度要根据菌株的生长特性进行调整，通常为4-8摄氏度。

5. 定期传代：定期传代菌株，避免菌株在长期保存过程中发生遗传变异或失活。

6. 保存记录：建立并及时更新菌株的详细保存记录，包括菌株的来源、保存时间、保存方式、特性描述等信息，以便于菌株的溯源和使用。

7. 双重保存：对于重要的菌种，可以考虑进行双重保存，即同时进行冷冻保存和恒温保存，以增加保存的安全性。

8. 定期检测：定期检测保存的菌株，包括菌株的纯度、生长状况和遗传特性等，确保保存的菌株依然具有所需的特性和活力。

以上是常见的菌种保藏要点，可以根据具体的实验需求和菌种特点进行调整和优化。

同时，注意进行合理的菌种管理和使用，以减少菌株的失活和遗传变异，保证科研的可靠性和稳定性。

酵母菌菌种保藏技术规程1范围本规程规定了酵母菌菌种保藏的技术和程序。

本规程适用于酵母菌菌种的保藏。

2术语和定义下列术语和定义适用于本规程2.1定期移植法subculturing亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，待得到健壮的菌体后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。

2.2蒸馏水法preservation in distilled water指将欲保藏的菌种细胞悬浮于无菌蒸馏水中，密封后置于4～6℃保存的一种菌种保藏方法。

2.3液体石蜡法preservation in liquid paraffin亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。

指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。

2.4－80℃冰箱冻结法preservation at －80℃指将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。

2.5液氮超低温冻结法preservation in liquid nitrogen指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。

2.6真空冷冻干燥法freeze-drying指将欲保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。

3保藏准备工作3.1菌种待保藏的酵母菌菌种必须进行分离纯化，得到纯培养后再进行保藏。

3.2工具、材料接种针或接种环、吸管、镊子、75%酒精棉球、酒精灯、试管架、量筒、烧杯、平皿、标签、波美计等。

3.3器皿3.3.1试管选用平口试管，规格一般为15×150mm。

3.3.2安瓿管制安瓿管的材料应为中性玻璃，质地软硬度要适当。

管的内径为8mm，长度不小于100mm。

果酒酵母发酵及菌种保藏选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。

1.实验目的和内容1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。

2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。

3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。

4）学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。

2.实验原理果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。

可用以下反应式来说明：果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。

在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。

果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。

用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。

按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。

微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

保藏方法大致可分为以下几种：1）传代培养保藏法又称斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6℃冰箱内保存。

2）液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。