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SDS碱裂解法制备质粒DNA步骤（1）挑取转化后的单菌落，接种到2ml的含有适当抗生素的丰富培养基中，37℃振摇培养过夜（培养物的体积小于溶液体积的1/4，否则容器不易盖紧，剧烈振摇培养）（2）收菌，将菌液倒入离心管中，4℃，12500r/min，3min。
（离心后将上清液倒入费废液缸中，倒扣在吸水纸上，若还有液体残留，用移液枪吸出）（3）将细菌沉淀重悬于100μl的预冷的碱性裂解液I（Glu, EDTA, Tris-Hcl）中，涡旋振荡。
（4）加200μl新配置的碱性裂解液II(0.2M NaOH,1%SDS)于每管细菌重悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次以混合内容物，切勿振荡，将离心管放置在冰上3-5min. （5）加150μl预冷的碱性裂解液III（CH3COOH,CH3COONa），盖紧管口，反复颠倒数次，使得溶液在粘稠度额细菌裂解物中分散均匀。
冰上防止3-5min。
（6）离心（4℃，12000r/min，6min），并将上清转移到另一个离心管中。
（7）在通风橱内加400μl的氯仿：异戊醇（24:1）（8）抽提：将管放在漂浮板上，划8字8min，后离心（4℃，12000r/min,7min），吸取上清液300μl到另一个离心管中。
（9）加无水乙醇600μl，混匀放置在-20℃沉淀15min，后离心（4℃，12000r/min,15min）（10）小心吸去上清液，将离心管倒置在吸水纸上，加70%乙醇700μl洗涤沉淀，弹起沉淀，浸泡一会，离心（4℃，12000r/min,4min），洗涤两次。
（11）倒掉上清，甩一下，吸去上清，晾干。
（12）TRE溶解（1mlTE，1μlRNA酶）20μl/管。
（13）65℃15min，后4℃冰箱保存。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
溶液Ⅰ50mM 葡萄糖/ 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。
这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。
2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置[t2]。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
碱裂解法提质粒原理详解碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法。
它利用高碱性溶液对细菌的细胞壁和膜进行破坏，释放出细胞内的质粒。
下面将详细介绍碱裂解法的原理及其步骤。
碱裂解法的原理基于细菌细胞壁和膜对碱性条件的敏感性，而质粒较为稳定，可以在高碱性溶液中存活。
在碱性条件下，细菌的细胞壁和膜会发生严重的破坏，释放细胞内的质粒。
此外，高温和刺激性离子（如氢氧根离子）也可以增加细胞壁和膜的破坏效果。
碱裂解法的步骤如下：1.首先，从含有目标质粒的培养基中取得细菌菌落，将菌落转移到含有适当抗生素的培养基中进行培养。
这是为了确保获得含有目标质粒的细菌。
2.将培养好的细菌转移到含有高盐浓度的溶液中。
高盐浓度可以破坏细菌细胞壁的结构，促进质粒的释放。
3.加入碱性溶液，通常使用0.2MNaOH或0.1MNaOH。
高碱性条件可以破坏细菌细胞膜，释放质粒。
此外，高温还可以增加细胞壁和膜的破坏效果。
4.在碱性条件下，轻轻搅拌混合物，以促进细胞壁和膜的破坏，并使质粒更易于释放。
5. 加入中和缓冲液（例如Tris-HCl），以中和溶液的pH值。
这是为了避免碱性条件对质粒产生不利影响。
6.将混合物进行离心，以分离细胞碎片和质粒。
离心过程中，较大的碎片会沉淀在离心管底部，而质粒会悬浮在上层液体中。
7.将上层液体转移到新的离心管中，并进行再次离心。
这是为了进一步净化质粒，去除可能残留的细胞碎片。
8.倒掉上清液，并用含有合适抗生素的培养基再次进行培养。
这是为了筛选出仍然带有目标质粒的细菌。
总的来说，碱裂解法通过破坏细菌的细胞壁和膜，释放出细胞内的质粒。
该方法简单、快速，并且适用于大多数质粒的提取。
然而，需要注意的是，碱裂解法也会破坏部分目标蛋白质的结构，因此在选择提取方法时需要综合考虑。
实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。
二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。
混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。
三、实验材料大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）四、实验仪器、用具高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪五、实验试剂LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖抽提质粒DNA所需的溶液：溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1%SDS(w/v)，现配现用；溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；六、实验步骤：1、质粒DNA的提取（1）在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37℃振摇培养过夜；（已经完成）（2）取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（3）加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀；（4）加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；（5）加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min；（6）12000rpm离心5min；（7）吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min；（8）小心移取上清液500μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）（9）加入200μL70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；（10）加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA，37℃放置10min。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理是利用碱性溶液将细菌细胞膜溶解，从而释放出质粒。
具体步骤如下：
1. 首先，培养含有目标质粒的细菌菌株，并收集足够数量的细菌细胞。
2. 将细菌细胞离心沉淀，去除上清液。
3. 使用含有碱性成分的溶液，如含有氢氧化钠和EDTA的碱
裂解液，将细菌细胞重悬。
4. 碱性溶液中的氢氧化钠会破坏细菌细胞膜的完整性，并且EDTA会螯合钙离子，进一步增强细菌细胞膜的脆弱性。
5. 经过一定时间的碱裂解作用，细菌细胞膜将被溶解，质粒被释放出来。
6. 使用中性化溶液，如盐酸或磷酸，可以调整溶液的酸碱度，使其接近中性，从而停止碱裂解的作用。
7. 利用离心的方法，将碱裂解液中的细菌残渣和其他杂质分离，得到含有质粒的上清液。
8. 最后，可通过柱层析等方法对上清液进行纯化，以获取纯净的质粒。
这种碱裂解法提取质粒的原理是利用碱性溶液破坏细菌细胞膜，从而释放出质粒。
与其他提取方法相比，这种方法简单易行，成本低廉，并且适用于大规模提取质粒。
大肠杆菌质粒提取碱裂解法-回复大肠杆菌质粒提取是一种常用的实验技术，可以用于分离和纯化重组DNA 质粒。
碱裂解法是其中一种常用的技术，本文将详细介绍大肠杆菌质粒提取碱裂解法的步骤和相关注意事项。
一、材料准备1. 大肠杆菌含质粒的培养物：可以选择含有目标质粒的大肠杆菌菌株。
例如，适用于蓝/白哺乳素筛选的菌株如DH5α。
2. 质粒纯化试剂盒：选择适合自己实验的质粒纯化试剂盒，可以根据需要选择小或大规模的提取试剂盒。
3. 离心管和离心机：用于离心大肠杆菌培养物和纯化DNA溶液。
4. 碱裂解缓冲液：可以通过自制或直接购买管制的缓冲液，如1 MTris-HCl (pH 8.0)、0.5 M EDTA (pH 8.0) 和10 SDS。
二、菌群扩增和收获菌株1. 从培养物中收取大肠杆菌：从10 mL 大肠杆菌培养物中取出适量菌液，可通过离心和倾倒上清液的方式收集菌块。
2. 重悬菌液：用无菌的PBS缓冲液洗涤菌块，再用10 mL 新鲜PBS缓冲液将菌块重悬。
3. 破碎细胞：将重悬的菌液转移至一个离心管中，对菌液进行破碎。
可以通过加入Lysozyme (100 mg/mL)、RNase A (10 mg/mL) 和TritonX-100 (1)来实现。
然后进行轻轻的颠倒以混合试剂。
4. 加入碱裂解缓冲液：向破碎的细胞中加入适量的碱裂解缓冲液。
一般来说，每个培养物使用5 mL缓冲液进行处理。
5. 匀浆与悬浮：用高速离心机对混合液进行离心，以沉淀细胞碎片。
然后将上清液转移到另一个离心管中，进行均匀悬浮。
三、纯化DNA1. 加入异丙醇：向菌液中加入等体积的异丙醇。
使用移液器将试剂静态混合。
2. DNA沉淀：将混合液高速离心，将沉淀的DNA从上清中分离出来。
沉淀的细胞碎片在离心管底部形成一个白色团块，而上清液大部分为透明的液体。
3. 洗涤：使用95 乙醇洗涤DNA沉淀物。
将95 乙醇分别加入到离心管中，并将其高速离心10分钟。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。
3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。
通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。
4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。
5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。
6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。
7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。
8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。
9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。
10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。
11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。
12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
质粒是一种裸露的、结构简单的小型环状DNA，它们存在于许多细菌细胞中，可以自主复制和表达。
质粒通常用于克隆和转化实验，是分子生物学实验中常用的工具之一。
一、实验目的通过碱裂解法提取质粒DNA，进一步了解质粒的基本性质和提取过程，为后续的分子生物学实验打下基础。
二、实验原理碱裂解法是一种利用细菌细胞壁和质粒DNA在不同pH值下稳定性的差异，将细胞壁和质粒DNA分离的方法。
在pH值高于7.5的环境下，细菌细胞壁的稳定性降低，而质粒DNA的稳定性相对较高。
通过加入碱液（如NaOH）并加热，可以破坏细菌细胞壁，使细胞内容物释放出来。
在pH值低于7.5的环境下，质粒DNA的稳定性降低，而细菌染色体DNA的稳定性相对较高。
通过加入高浓度的醋酸钾溶液并冰浴，可以沉淀出染色体DNA，而质粒DNA则留在上清液中。
三、实验步骤1.准备所需试剂和器材，包括细菌培养液、NaOH、KAc、冰浴、离心管、移液器等。
2.将细菌培养液倒入离心管中，用移液器加入适量NaOH，搅拌均匀。
3.将离心管放入沸水浴中加热5分钟，使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物。
4.用移液器加入适量KAc，搅拌均匀，使pH值降低至7.5以下。
5.将离心管放入冰浴中冷却10分钟，使染色体DNA沉淀出来。
6.用离心机将上清液和沉淀物分开，收集上清液。
7.在收集的上清液中加入适量的乙醇，放在-20℃冰箱中冷冻1小时，使质粒DNA沉淀出来。
8.用离心机将沉淀物和上清液分开，收集沉淀物。
9.用适量的TE缓冲液溶解沉淀物，得到质粒DNA溶液。
10.用紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度和质量。
四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过紫外分光光度计测定，得到质粒DNA溶液的浓度和质量。
通常，提取到的质粒DNA溶液需要有一定的浓度和质量才能进行后续的分子生物学实验。
2.数据分析：根据实验数据可以分析出提取到的质粒DNA溶液的质量和浓度是否符合要求。
碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
碱裂解法抽提质粒的原理SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。
1．试剂（1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V)（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml（4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）（5）无水乙醇和70﹪乙醇（6）无DNA酶的胰RNA酶（7）TE2．实验流程（1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml 含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。
（2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。
（3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。
溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。
因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。
乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。
（5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。
确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。
注意不要振荡。
将离心管放置于冰上5分钟。
注：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒及染色体的DNA。
溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O 至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。
2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置。
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。
5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。
4℃保存备用。
4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。
二、操作步骤1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000g×30S，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0））中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，（且不至于沉淀）。
4. 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
革兰氏阳性菌质粒碱裂解法提取具体步骤：（1）将待检测菌株接种于3 mL LB或BHI培养基（含终浓度为170µg/mL的氯霉素）中，37℃培养过夜；（2）取1.5 mL上述菌液于2 mL离心管，12,000×g，离心0.5min，尽可能吸尽上清液，若菌体过少可重复一次；（3）加入1mL STE缓冲液（pH8.0），用旋涡振荡器充分悬浮菌体，再12,000×g，离心2min，尽可能吸尽上清液，重复1~2次以洗涤菌体；（4）加入150 µL冰预冷碱裂解液Ι，用旋涡振荡器充分悬浮菌体；然后，加入40 µL溶菌酶（10mg/mL），此时不得涡旋！上下颠倒离心管、混合均匀，然后37℃放置30~45min；（5）沿管壁加入300 µL现配碱裂解液Π，轻轻颠倒离心管4~ 5 次，混合均匀、不得涡旋，置于冰上5 min；（6）迅速加入200 µL冰预冷碱裂解液Ш, 轻轻颠倒离心管4~ 5 次, 混合均匀、不得涡旋，置于冰上3~5min;之后，12000×g，4℃离心8min（也可室温离心5 min）；（7）用移液器将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，加入1倍体积酚/氯仿（1:1）抽提，12,000×g离心5 min，重复操作一次；（8）移取上清液移至新的1.5 mL离心管中，加入1倍体积冰预冷无水乙醇和0.1倍体积3M 醋酸钠，室温沉淀10min（或4℃沉淀过夜），12,000×g离心5 min，尽量去掉酒精；（9）用0.5 mL冰预冷70％酒精洗DNA沉淀一次，12,000×g，4℃离心2 min，小心地吸去上清液，室温风干10 ~15 min；（10）加50µLTE缓冲液（含终浓度为50µg/mL的RNaseA酶，pH8.0）溶解DNA沉淀，-20℃保存。
试剂配制:（1）LB培养液：Tryptone 10 gYeast Extract 5 gNaCl 10g双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。
碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml离心管中，4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。
7、将水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl STE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。
[注意]1.提取过程应尽量保持低温。
2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
实验原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。
该方法提取质粒DNA是基于
线性染色体DNA与共价闭环质粒DNA在拓扑学上的差异而达到分离目的的。
在pH12.0~ 12.5的碱性条件下,染色体线性DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开;共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
当pH调至中性并在高盐及低温条件下,大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA留在上清中,然后用有机溶剂酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA
●是基于线性染色体DNA与共价闭环质粒DNA在拓扑学上的差异而达到分离目的
●在pH12.0~12.5的碱性条件下
●细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋
结构被破坏而发生变性。
●共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态
●pH调至中性并在高盐条件下,大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS
的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态
三种溶液
平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大
量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了
醋酸：
是为了中和NaOH
75%酒精：
主要是清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强
酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上
步骤
具体步骤参见对应试剂盒
DNA提取基本步骤：
●材料准备
●破碎细胞或包膜——内容物释放
●核酸分离纯化
●沉淀或吸附核酸,并去除杂质
●溶解核酸于缓冲液或水中。
