菌种的衰退、复壮和保藏

食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮今天要和大家介绍的是食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮，这是食用菌生产过程中少不了的步骤。

一、菌种贮藏原理食用菌菌种是国家重要的种质资源。

菌种保藏是食用菌生产中的一项必不可少的环节。

食用菌和其他生物一样，都具有遗传性和变异性。

遗传性保证了子代遗传特征的相对稳定，为菌种贮藏提供了条件；变异性使子代的性状与亲本相比会发生某些改变，给菌种的保藏带来了困难。

食用菌菌种在长期的栽培和保藏过程中，由于传代次数过多或不利环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。

因此，要想在一定时间内使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就应该采取一定的措施，进行菌种保藏工作。

菌种保藏的目的是在特定条件下，降低菌种的代谢速度，使其处于休眠或半休眠状态，在一定的保藏期内，确保菌种的纯度，防止病虫害感染，以保持菌种的优良性状，当条件适宜时又可以重新恢复生长繁殖。

菌种保藏的基本原理是采用低温、干燥、饥饿、缺氧等方法，以抑制菌丝生长，降低代谢速度，使菌丝处于休眠或半休眠状态，并保证菌种的纯度。

二、菌种复壮从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，进行分离、培养，从而达到恢复菌种优良性状的过程就叫菌种复壮。

在实际生产中，多是在菌种尚未退化之前进行菌种复壮。

(一)菌种复壮原理生物以遗传变异为基础，通过自然选择和人工选择得以进化。

变异提供了选择的基础，选择保存了适应环境的个体，保存的个体使遗传特征得以遗传。

如此再变异、再选择、再遗传，循环往复，使生物得以不断进化。

菌种复壮就是依据这个原理进行的。

(二)菌种复壮方法1.挑选健壮菌丝进行接种：每次转接菌种时都挑选健壮菌丝进行接种是防止菌种衰退的有效、简便的措施。

2.进行分离复壮：从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，通过分离进行复壮。

如菌丝分离，用无菌水将斜面上的菌丝稀释，再将菌丝体放入装有无菌蒸馏水的三角瓶中摇匀，然后转接到平板培养基上，使菌丝分布均匀，适宜条件培养至萌发成菌落。

菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。

具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。

2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。

广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。

（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。

⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。

这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。

⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。

2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。

答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。

菌种生长的四个阶段
菌种生长的四个阶段是：
1. 潜伏期：在此阶段，菌种进入一个休眠状态，准备开始生长。

在这个阶段，菌种通过吸收营养物质和水分来增加其体积和质量。

2. 对数增长期：在这个阶段，菌种开始快速生长和繁殖。

菌群数量以指数方式增加，菌丝网络扩展，并形成新的孢子。

在这个阶段，菌种对于适宜的温度、湿度和营养物质非常敏感，因此提供适宜的环境条件非常重要。

3. 稳定期：在这个阶段，菌种开始达到一个稳定的生长状态。

菌群数量不再继续增加，而是保持相对稳定。

此时，菌种可能会产生更多的代谢产物，如酸、酶或药物。

4. 衰退期：在这个阶段，菌种的生长速度开始减缓并逐渐停止。

此时，菌种的资源和营养物质可能已经消耗殆尽，或者环境条件发生了变化，不再适合菌种的生长。

菌群数量开始减少，菌丝网络也开始退化。

菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？在食用菌生产中，由于各种原因，常使菌种遗传物质发生变异，进而出现优良性状减退或消失、产量降低、质量下降等现象，这就是菌种退化。

（一）菌种退化：1.菌种退化的实质：菌种退化的实质是遗传物质发生了可遗传的变异。

菌种退化是一个从量变到质变的渐变过程，当发生有害变异的个体在群体中显著增多，以致占据优势时才会表现出来。

对于群体来说，个别细胞的退化变异会随着细胞的分裂而逐步增加，使衰退的个体逐渐增多，最后使整个群体发生严重的衰退。

虽然菌种退化现象普遍存在，但可以采取适当措施延缓其退化进程，将群体的退化控制在最低限度。

尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种退化却需要较长的时间。

因此，在退化的菌种中，经常有少数尚未退化的个体，这是菌种复壮的基础。

2.菌种退化的原因与表现：菌种退化的主要原因是交叉感染、自体杂交、基因突变、培养条件不适等，病毒感染也会引起菌种退化。

食用菌菌种感染病毒后，病毒数量不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增加，而且还会通过带毒的孢子传给下一代。

当菌种携带一定浓度的病毒粒子时，在栽培中就会表现出产量降低、质量下降等退化现象。

菌种退化除了与其自身的遗传特性和所处的环境密切相关之外，还受转管次数、机械创伤等外界因素影响。

菌种退化的主要表现是理想的优良性状逐渐丧失，继而出现菌丝生长势弱、代谢能力下降、产量降低、易受病虫害感染等。

3.防止菌种衰退的措施：在某种意义上，菌种退化是必然发生的现象，但依然可以采取多种措施防止菌种过早衰退。

（1）控制母种转管次数：从理论上讲，菌种可以进行多次转接；但由于在操作中菌丝受机械创伤等影响，会使菌种产生突变，而多数突变对菌种是不利的。

因此在可能的情况下，尽量减少转管次数。

实践证明，生产上用的菌种转接控制在5代范围内较为合适。

（2）防止菌种混杂在菌种转接、出菇管理等过程中，加强品种隔离管理，减少品种间相互混杂的机会，防止不同品种的孢子四处传播，以保证优良品种的遗传特性相对稳定。

第五节菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。

影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。

因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。

对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。

一、斜面冰箱保藏法一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。

保存期3月到6月。

二、沙土管保藏法适合于产孢子或芽孢的微生物。

首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。

一般沙80目，土80一100目。

其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。

或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。

保存期1年左右。

三、菌丝速冻法不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。

该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。

甘油最终浓度为25％。

操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。

四、石蜡油封存法向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。

此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。

保存期约1年五、真空冷冻干燥保藏法是目前国内外较理想的常用方法。

其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。

在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。

菌种可保存5年左右。

菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。

2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。

病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。

保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。

保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。

菌种保藏和复苏-精简版菌种的保藏与复苏⼀、菌种保藏（⼀）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微⽣物菌种⽤各种适宜的⽅法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。

菌种保藏有许多的⽅法，其共同的⽬标是把菌株的优良性状保存下来，防⽌退化、死亡或杂菌污染。

（⼆）菌种保藏的原理微⽣物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微⽣物的代谢处于最不活跃或相对静⽌的状态，才能在⼀定的时间内使其不发⽣变异⽽⼜保持⽣活能⼒。

低温、⼲燥和隔绝空⽓是使微⽣物代谢能⼒降低的重要因素，所以，菌种保藏⽅法虽多，但⼤都是根据这三个因素⽽设计的。

其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常⽤的⼀种简单易⾏的⽅法。

在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。

在缓慢冷冻时，胞外基质⼀般较快结冰⽽形成冰晶使基质浓度增⾼，造成细胞⽔分外渗⽽⼤量脱⽔，可能使细胞死亡。

如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较⼩，对细胞及原⽣质膜的损伤也较⼩，菌株不易死亡，影响也较⼩。

与低温相关的保藏⽅法，如冷冻⼲燥法、超低温保藏法等，都是利⽤低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理⽽设计的。

（三）菌种保藏的⽅法本实验室常⽤菌种保藏⽅法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌⽣长充分以后，转移⾄4°C冰箱中保存。

平板在4°C存放时，最好⽤封⼝膜封⼝，不能长时间存放，⼀般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。

此法仅⽤于⼯作⽤菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。

2.⽢油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利⽤10-15%的⽢油进⾏冻存。

⽢油的作⽤：⽢油能够提⾼⽔体的粘稠度，使其冰点提⾼，防⽌细胞内部产⽣冰晶造成细胞的损害，⼀般使⽤⽢油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产⽣毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议⽢油终浓度为8-10%，⽢油浓度太⾼会导致质粒的不稳定。