猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达

新疆农业大学学报２００８，３１（４）：８３～８６　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　

文章编号：１００７－８６１４（２００８）０４—００８３—０４　

猪繁殖与呼吸综合征病毒ＯＲＦ５基因的　

克隆、表达与免疫印迹　

刘　焕　，冉多良　，王一成　，袁秀芳　，徐丽华　

（１．新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐８３００２５；２．浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州　３２００２１）　

摘要：将猪繁殖与呼吸综合征病毒ＯＲＦ５基因克隆入原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）的多克隆位点中，经鉴定后得　到重组质粒ｐＥＴ—ＯＲＦ５，将此重组质粒分别转化到受体菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）中，并用诱导剂ＩＰＴＧ进行诱导表达，　２　ｈ后表达达到高峰。经１５　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，表达得到的蛋白大小约为１３．７５　ｋＤ。经Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ分　析，表达蛋白能与ＰＲＲＳＶ阳性猪血清发生特异性反应，而与阴性血清不反应，具有较好的免疫原性，为研究　

ＰＲＲＳＶ亚单位疫苗奠定了基础。　

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；ＯＲＦ５；克隆；表达　中图分类号：Ｑ７８６　文献标识码：Ａ　

Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　Ｂｌｏｔ　ｏｆ　ＯＲＦ５　ｏｆ　ＰＲＲＳＶ　

ＬＩＵ　Ｈｕａｎ　’　。ＲＡＮ　Ｄｕｏ—ｌｉａｎｇ　。ＷＡＮＧ　Ｙｉ—ｃｈｅｎｇ　，ＹＵＡＮ　Ｘｉｕ—ｆａｎｇ　，ＸＵ　Ｌｉ—ｈｕａ　

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００２５；２．Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ａ—　

ｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３２００２　１）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ＯＲＦ５　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＰＲＲＳＶ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｗｉｔｈ　ａ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　３７５　ｂｐ．Ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ＤＮＡ　

・２８・　试验研究　广东畜牧兽医科技２０１　０年　３５　龟２　

猪繁殖与呼吸综合征病毒Ｅ基因的克隆　

及其腺病毒表达载体的构建　

邓碧亮　，顾万军ｚ，黄毓茂。　（１．河源市动物疫病预防控制中心，广东河源５１７０００；２．佛山科学技术学院生命科学学院，　广东佛山５２８２３１；３．华南农业大学兽医学院，广东广州５１０６４２）　

摘要：本研究通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增猪繁殖与呼吸综合症病毒（ＰＲＲＳＶ）ＧＤ株的Ｅ蛋白基因，克隆至　穿梭质粒ｐＳｈｕｔｔ１ｅ－ＣＭＶ　ｖｅｃｔｏｒ中，构建腺病毒重组表达载体。经过抗性筛选、ＰＣＲ扩增、单酶切等方法对　其进行鉴定，确定得到了含有目的基因的阳性克隆，成功构建了腺病毒表达载体ｐＡｄ—Ｅ。同时转染２９３细　胞并进行了初步鉴定，进一步的研究还在继续。本研究为ＰＲＲＳＶ结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定　了基础。　关键词：ＰＲＲＳＶ；基因克隆；重组腺病毒　中图分类号：￥８５６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５—８５６７（２０ｌＯ）０２～００２８—０３　

Ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅ　ｏｆ　Ｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＰＲＲＳ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ａｄｅｎｏｖｉｍｓ　

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　．　

ＤＥＮＧ　Ｂｉ—Ｌｉａｎｇ　，Ｇｕ　Ｗａｎ－ｊｕｎ２，ＨＵＡＮＧ　Ｙｕ・Ｍａｏ　（１．Ｈｅｙｕａｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｈｅｙｕａｎ　５１７０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＬｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆＦｏＳｈａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＦｏＳｈａｎ　５２８２３　１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｏｕｔｈ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１　０６４２，Ｃｈｍａ）　

Ａｂａｎａｏｔ：Ｔｈｅ　Ｅ　Ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＰＲＲＳ　ｖｉｒｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　ＧＤ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ＲＴ．ＰＣＲ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＳｈｕｔｔｌｅ．ＣＭＶ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＰＣＲ　ａｎｄ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｍｒ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ　２９３　ｅｅｌｌ　ｗａｓ　ｔｍｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＳｈｕｔｔｌｅ．ＣＭＶ　ａｎｄ　ｔｈｅ￣ｒｔｈｅｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｏｎｅ　ｌａｔｅｒ．Ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｐｌａｙｅｄ　ａ　ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｖａｃｃｉｎｅ．　Ｋ　ｗｏＩｄ８：ＰＲＲＳ　ｖ；ｇｅｎｅｃｌｏｎｅ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　

动物医学进展，２０１０，３１（８）：８—１１　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒　

ＯＲＦ３基因的原核表达　

徐明明　。，刘永刚　，王淑杰　，武嘉男　，石文达　，李丽琴　，荣福龙　，蔡雪辉。　（１．东北农业大学，黑龙江哈尔滨１５０００１；２．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所　兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨１５０００１）　

摘　要：为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）ＧＰ３蛋白的结构、功能及免疫学特性，根据　

ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的高致病性ＰＲＲＳＶ　ＨｕＮ４株ＯＲＦ３基因序列，设计合成扩增ＰＲＲＳＶ　ＯＲＦ３基因的引　物。将扩增的基因克隆到表达载体ｐＰｒｏＥｘ　ＨＴｂ中，转化到大肠埃希菌ＢＬ２１进行表达。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分　

析表明，ＧＰ３蛋白在大肠埃希茵中获得正确表达，且具有良好的反应活性。将纯化的ＧＰ３蛋白免疫小鼠制　备抗ＧＰ３多克隆血清，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）测定其效价，结果在小鼠体内产生较高滴度的特异性抗　

体，证明ＰＲＲＳＶ　ＧＰ３蛋白具有良好的抗原性。　关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒；ＯＲＦ３蛋白；原核表达；抗原性　

中图分类号：￥８５２．６５９．６；￥８５８．２８　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—５０３８（２０１０）０８—０００８—０４　

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ）属于尼多病　

毒目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）、动脉炎病毒科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、动　脉炎病毒属（Ａ　ｅｒｉｖｉｒｕｓ），能引起猪繁殖与呼吸综合　

征（ＰＲＲＳ），俗称“猪蓝耳病”。临床表现为母猪晚期　

流产、早产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和各年龄猪群　的呼吸道症状。该病于１９９６年在我国有发生的报　

２０１０年２３卷５期　Ｖ０Ｌ　２３　Ｎｏ．５　西南农业学报　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　１６８３　

文章编号：１００１—４８２９（２０１０）０５—１６８３—０６　

猪繁殖与呼吸综合征病毒Ｎｓｐ２的　

原核表达及单克隆抗体的制备　

严玉霖，高　洪　，陈　玲，陈培富，杨建发，孙文汇，高利波，赵　汝　

（云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明６５０２０１）　

摘要：以猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）为模板，通过ＲＴ—ＰＣＲ扩增编码非结构蛋白２（Ｎｓｐ２）的基因，插入到ｐＥＴ３２ａ表达载　

体中并在大肠埃希氏菌中进行表达。ＳＤＳ・ＰＡＧＥ电泳结果显示融合表达的Ｎｓｐ２分子量约为６８　ｋＤａ，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析该融合蛋　白能与ＰＲＲＳＶ阳性血清发生特异性反应。纯化融合表达产物Ｎｓｐ２，按１００　ｇ／只的剂量与等量弗氏佐剂乳化，经腹腔免疫ＢＡＬＢ／　

ｃ小鼠３次后，取脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，分别以Ｎｓｐ２和Ｈｉｓ—Ｔａｇ为抗原，通过间接ＥＬ　ＩＳＡ方法对融合细胞的上清　

液进行检测，筛选阳性克隆。经过３次亚克隆后，最终得到了６株能稳定分泌抗Ｎｓｐ２抗体的阳性细胞克隆株。间接免疫荧光试　验、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ和间接ＥＬＩＳＡ试验鉴定这６株单克隆抗体均能够特异、单一地识别Ｎｓｐ２，亚型鉴定结果显示６株单抗均属　

ＩｇＧ２ａ型，其轻链均为Ｋ链。所制备的这些单抗将为鉴定ＰＲＲＳＶ　Ｎｓｐ２的Ｂ细胞抗原表位以及分析该蛋白的结１勾和功能奠定基　

础。　

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；非结构蛋白２；单克隆抗体　

中图分类号：ｓ８２８　文献标识码：Ａ　

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｓｐ２　Ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＰＲＲＳＶ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｎｓｐ２　

ＹＡＮ　Ｙｕ・ｌｉｎ，ＧＡＯ　Ｈｏｎｇ‘，ＣＨＥＮ　Ｌｉｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｐｅｉ—ｆｕ，ＹＡＮＧ　Ｊｉａｎ—ｆａ，ＳＵＮ　Ｗｅｎ—ｈｕｉ，ＧＡＯ　Ｉｊ－ｂｏ，ＺＨＡＯ　Ｒｕ