多克隆抗体制备综合性实验 - 副本

多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。

多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。

制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。

一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。

抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。

选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。

抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。

二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。

在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。

还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。

三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。

首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。

在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。

免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。

四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。

随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。

五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。

之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。

六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。

最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。

多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。

多克隆抗体制备克隆抗体是一种由抗原催化，从单克隆抗体产生来源的原核或真核抗体，由单株抗原调节器培养的克隆表达系统来制备。

它是一种从单克隆抗体产生来源的原核或真核抗体，广泛田间地走在研究免疫体系中，在流行性疾病筛查，检测和新药研发中发挥着重要作用。

经过多次迭代，可以有效的改善克隆的稳定性和效率，也可以有效地延长克隆的可用性。

本文综述了克隆抗体的基本原理及其制备方法。

建立原核或真核克隆抗体的细胞模型包括两个抗原调节器，一个是负调节器，另一个是正调节器。

负调节器通常由带有表达调节核苷酸（如表达强迫蛋白）组成，正调节器由表达调节核苷酸（如自表达调控元件）和表达抗原基因组成。

正调节器激活抗原基因表达，而负调节器则阻止抗原基因表达。

这样，调节器就可以控制抗原表达，从而实现克隆抗体的稳定生产。

为实现克隆抗体的生产，通常用培养的表达系统，在这种系统中，克隆基因可以独立表达，避免基因杂交而形成杂合复合体而影响抗原的活性。

这些系统中可以使用不同负调节因子和促进因子，控制不同抗原表达。

由于克隆抗体是以DNA编码的，因此可以通过多种方式实现克隆抗体制备，例如构建克隆板、复制抗体Gene libraries的构建、克隆表达系统的建立与克隆筛选等方法结合起来实现生产。

克隆板的建立主要利用基因切割和位点突变的技术，来筛选出所需的表达th=基因，从而获得克隆抗体。

复制抗体Gene libraries的构建主要是利用基因组学技术，从自然进化中获取特定抗原表达的基因。

在克隆表达系统建立过程中，会选择合适的负调节因子和促进因子，来实现对特定抗原的表达，并通过克隆筛选实现克隆抗体的连续生产。

克隆抗体被用于一系列疾病、感染和肿瘤等疾病的研究，如癌症、艾滋病和病毒感染研究。

它们由表达抗原的克隆细胞所产生，是一种具有特定抗原结构的特异性抗体，可用于识别肿瘤细胞，检测药物的活性和作为药物的新靶标。

总之，克隆抗体制备技术为研究免疫反应和制备特异性抗体提供了一种有效的平台，其抗击重要疾病的作用无可比拟。

多克隆抗体的制备流程及原理
多克隆抗体的制备流程及原理可以参考以下步骤：
1. 抗原免疫：使用目标抗原免疫动物，例如小鼠，在一定时间间隔内多次免疫。

抗原可以是纯化的蛋白质、多肽片段或者细胞/组织提取物。

2. 细胞融合：将免疫小鼠脾脏与骨髓中的浆细胞混合，然后使用聚乙二醇等方法促使细胞融合，获得杂交瘤细胞。

3. 杂交瘤筛选：将杂交瘤细胞悬浮液分别分装于多个培养皿中，含有杀死未融合细胞的培养基中，通过限制性稀释法或离子交换法，筛选出高产、单克隆抗体的杂交瘤细胞。

4. 单克隆抗体培养与提取：将筛选出的单克隆杂交瘤细胞进行扩增培养，获取大量的细胞。

然后通过细胞培养上清液、腹水或腹水灌洗法获得单克隆抗体。

多克隆抗体制备的原理如下：
多克隆抗体是指由多个不同的抗体产生细胞(即多克隆细胞)产生的一类抗体。

其制备的原理是通过免疫动物多次免疫，激发机体产生大量的抗原特异性抗体。

不同的抗原特异性抗体由不同的抗体产生细胞产生，并经过体内的嫁接与筛选，获
得了多个具有抗原特异性的抗体。

多克隆抗体具有较广泛的抗原特异性，可以识别目标抗原的不同位点，因此可以广泛应用于免疫学、分子生物学、生物医学等领域。

实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。

⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。

⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。

一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。

多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。

将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。

如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。

通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。

首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。

但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。

免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。

三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。

通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。

【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。

⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。

⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。

⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。

由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。

第一节抗原的制备除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。

由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。

一、抗原的提取抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。

根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。

由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。

因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。

如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。

抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。

③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。

现分别简述如下。

（一）材料的选择及预处理选择什么材料主要根据实验目的而定。

通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。

材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。

若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。

某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。

（二）细胞的粉碎除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。

多克隆抗体制备综合性实验实验原理：抗体是在抗原刺激机体免疫系统后，活化的B淋巴细胞针对抗原决定簇产生抗体，由一个B细胞细胞克隆针对某一抗原决定簇产生的抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）。

若由多抗原决定簇刺激机体，相应活化多个B细胞克隆，产生多种McAb的混合物，称之为多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb）。

抗体的制备包括抗原的制备和纯化、动物免疫和血清分离纯化与鉴定。

许多免疫学诊断都以抗原抗体反应为基础。

实验操作：1.抗原的制备（第一周）用抗原刺激机体可使机体产生抗体，抗原的性质、纯度和活性影响其免疫动物后获得抗体的特异性和效价。

为了提高抗原的免疫原性以获得高水平的抗体，一般需在可溶性抗原中加入佐剂。

本实验抗原为混合人全血清（20份血清混合）。

以下步骤需无菌操作（1）混合20份人全血清。

（2）取混合人全血清，用生理盐水1:4稀释。

（3）将稀释血清按与完全佐剂1:1体积的比例混匀，制成油包水状态。

将佐剂5 ml置磁力搅拌器上，边搅拌边滴加抗原，继续搅拌使其完全乳化。

将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化。

乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果。

完全乳化标准：(1) 取1滴至冰水表面，若乳剂稳定，在冰水表面不会扩散。

(2) 振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。

2.基础免疫(1) 固定家兔(2) 剪去家兔颈背部、大腿、足底的毛，碘酒和酒精棉球消毒。

(3) 免疫方法可采用背部多点注射法。

即于家兔脊柱两旁、大腿、足掌选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，每只家兔共注射1ml。

间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好）。

抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。

捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中。