蛋白质含量的测定方法及原理

6种方法测定蛋白质含量

[ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2006-12-25| 字体： [大 中 小]

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)

2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)

(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)

反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白

氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、双缩脲法（biuret法）

（一）实验原理

双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材 1. 试剂：

蛋白质含量测定

院系名称 食品与生物工程学院

学生姓名 孙 洪 磊

学号 200606021064

专业班级 生 工 06 - 2

指导教师 马 美 范

二○○九年四月一日

蛋白质含量测定方法比较

蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法

（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。

一、双缩脲法（Biuret法）

（一）实验原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这

类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质

实验报告：蛋白质含量测定方法的研究

一、 研究背景及目的

目前常用的有四种蛋白质含量测定方法：凯氏定氮、Folin-酚法、染料结合法、紫外法。根据特征吸收峰的原理，技术上也有分光光度计的支持，比色法（Folin-酚法、染料结合法、紫外法）最常用于蛋白质含量的测定，广泛运用于生产生活中。实际中生物材料来源广泛，具有多样性，这就涉及到测定过程中如何正确选择合适的测定方法，首先要研究生物材料中的非蛋白干扰因素是否会对测定结果产生确切影响。可以通过三种方法的测量结果与真值的比较，得到最佳测定方法，但事实上，真值并不可知，缺乏最明确的定量参照关系。需要绕开真值，寻求另外一种方法，其可代替真值的属性。用三种方法分别测定一种纯蛋白溶液的蛋白含量，计算出这三个值的离散系数a (离散系数=（标准差/平均值）×100%)，其中包括实验原理本身的误差和操作误差；再用三种方法分别测定生物材料中的蛋白含量，也计算出这三个值的离散系数b，其中包括实验原理本身的误差、操作误差和非蛋白物质的干扰。计算出相对极差c:（b-a）/((a+b)/2)。从分化角度分析，比较c和3‰的大小关系，大于则有影响，小于或等于则没有影响。从而，达到探究非蛋白干扰因素是否会对测定结果产生影响的目的。

二、 原理

紫外法测定原理：蛋白质中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，在280nm处存在吸收峰，在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度值与其浓度成正比，可作定量测定。技术上有UV9600紫外分光光度计的支持。

Folin-酚法测定原理：蛋白质中所含的酪氨酸和色氨酸等残基数与蛋白质含量成正比。蛋白质中的肽键与试剂甲生成络合物，由于蛋白质中存在含有酚基的氨基酸，络合物可与试剂乙发生反应，反应颜色与蛋白质的含量成正比，据此可作定量测定。技术上有722-光栅分光光度计支持。

染料结合法测定原理：在一定蛋白质浓度范围内（0-1000μg/ml），考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后的蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，可用于蛋白质含量的测定。技术上有722-光栅分光光度计支持。

一、目的与要求

1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。

二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。

三、仪器与试剂

硫酸铜（CuSO4·5H20） 硫酸钾 硫酸（密度为L） 硼酸溶液（20g/L）

氢氧化钠溶液（400g/L） L盐酸标准滴定溶液。

混合指示试剂：%甲基红乙溶液液1份，与%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。

微量定氮蒸馏装置：如图3- 所示。

图3- 微量凯氏定氮装置

1、电炉； 2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a；

4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；

7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。

四、实验步骤

1、样品消化

称取样品约（±），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。

试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。

2、定氮装置的检查与洗涤

检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。 测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。