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IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测江冠民;匡艳华;邱瑜;谢婉莹;张秋桂;欧阳新平【摘要】Objective To construct two luciferase reporter gene vector pGL3-Enhancer-ISRE4 and pGL3-Enhancer-GAS7 , and to identify their biological activity of them. Methods The promoter sequences ISRE4 (4 series ISRE sequence) and GAS7 (7 series GAS sequence) were synthesized which regulate the expression of IDO,then they were cloned into empty vector pGL3-Enhancer respectively to construct two luciferase reporter vectors pGL3-Enhancer-ISRE4 and pGL3-Enhancer-GAS7 ,which were amplified by transformation and identified by restriction enzymedigestion,sequencing,and the biological activity detecting. Re-sults Two luciferase reporter vectors pGL3-Enhancer-ISRE4 and pGL3-Enhancer-GAS7 were successfully constructed,the ex-pression of luciferase could be induced by IFN-γ. Conclusion The two luciferase reporter gene vectors of pGL3-Enhancer-ISRE4 and pGL3-Enhancer-GAS provide a very important tool for studying the regulation mechanisms of IDO protein expression and supplying a fast,high-throughput screening for anti-tumor immune tolerance drug which targeting the IDO.%目的构建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。
-----------------------------------Docin Choose -----------------------------------豆 丁 推 荐↓精 品 文 档The Best Literature----------------------------------The Best Literature热带医学杂志2009年2月第9卷第2期·硕博专栏论著·[文章编号]1672-3619（2009）02-0147-04基金项目：广东省自然科学基金（No．32874）；广东省医学科研基金（No．2004382）。
作者简介：刘贝娜（1982－），女，硕士研究生，主要从事鼻咽癌基因多态性方面的研究。
*通讯作者：何英，女，硕士生导师，副主任医师，E-mail ：ying-h＠tom．comPLUNC （palate ，lung and nasal epithelium clone ）基因即腭、肺、鼻上皮细胞克隆，多在口腔、鼻、呼吸和消化道的上皮表面或分泌腺中高表达［1－3］。
多项研究表明PLUNC 基因与鼻咽癌关系十分密切，其表达下调可能有助于鼻咽癌的发生，为抑瘤基因的候选者［4，5］。
我们前期对该方面也做了更深入的研究［6］，发现hPLUNC 基因启动子区多态位点C－1888T 与中国广东人群鼻咽癌易感性关系非常密切（OR＝2．8－3．3，P ＜0．001），而且携带单倍体型C－C 的个体更易患鼻咽癌（OR＝1．86，95％CI＝1．34－2．56，P ＝0．00016），说明hPLUNC 基因的遗传多态性可能影响了广东人群鼻咽癌的易感性。
本研究采用PCR 技术从人类基因组中克隆了PLUNC 基因1888位点含C ／T 的2种单倍体型的荧PLUNC 基因启动子区荧光素酶报告载体的构建与鉴定刘贝娜1，何英1*，王爽2（1．南方医科大学南方医院耳鼻咽喉头颈外科，广州510515；2．南方医科大学病理学教研室，广州510515）【摘要】目的构建人PLUNC （palate ，lung and nasal epithelium clone ）基因启动子区C-1888T SNP 位点不同单倍型荧光素酶报告基因表达载体。
Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测(1)作者：丁睿，韩霜，雷婷，刘杰，窦科峰【摘要】目的：扩增Id1启动子基因，构建Id1启动子的报告基因载体.方法：通过PCR及双酶切方法，从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列；分别克隆到报告基因pGL3 enhancer载体上，构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体；用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系；采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性.结果：经PCR方法扩增出大小分别为1096bp和266bp的两段不同长度的Id1启动子片段，序列测定其编码序列及读框正确，酶切鉴定亚克隆序列正确.瞬时转染HepG2后经报告基因检测，两段启动子均具有转录活性.结论：成功构建了Id1启动子的报告基因载体，为进一步研究Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础.【关键词】分化抑制因子0引言Id蛋白即分化抑制或DNA结合抑制蛋白（InhibitorofDifferentiationand/orDNAbindingprotein s）是缺少DNA结合结构域的螺旋 环 螺旋（helix loophelix，HLH）蛋白，是HLH转录因子的显性负性调节分子.已知哺乳动物Id蛋白家族有Id1～Id4等4位成员.它们可调节多种细胞进程，包括细胞生长、衰老、分化、凋亡和血管生成等［1］.研究［2］表明Id蛋白特别是Id1，可通过灭活肿瘤抑制因子和激活生长促进通路而促进哺乳动物细胞的增殖和细胞周期的进行，其可能是肿瘤增殖所必需的关键因子.Id1可能是预测慢性肝炎肝硬化患者的肝癌发生风险的有用指标，并且可作为治疗肝癌的靶向分子.我们拟构建两段包含不同长度Id1启动子片段的报告基因载体，转染HepG2细胞后检测两段Id1启动子的活性.1材料和方法材料pGL3 enhancer载体，内参照pRL TK载体和Dual luciferasereporterKit（Promega公司）；LipofectaminTMReagent和T4DNA连接酶（Invitrogen公司）；细胞基因组DNA提取试剂盒（U gene公司）；高保真TaqDNA 聚合酶（上海生物工程公司）；PlasmidMiniprepKit和GelExtrationKit（Omega公司）；DNAmarker:GeneRulerTM100bpDNAladderPlus和GeneRulerTM1KbDNAladder（MBI公司）；胰蛋白胨及酵母提取物（宝泰克公司）；限制性内切酶HindⅢ，KpnⅠ（大连宝生物工程公司）；其余试剂均为国产分析纯.TD20/20荧光照度计（TurnerBioSystems公司）；HepG2细胞和JM109菌株均为本实验室保存.方法启动子报告基因载体的构建引物设计自http://网站数据库检索获得Id1（GenBank /EMBL提取号码：NM 002165）启动子序列的-3000～100部分序列，分别设计两段启动子引物序列，并在上游引物5′端加入KpnⅠ的酶切位点GGTACC，在下游引物5′端加入HindⅢ的酶切位点AAGCTT.从转录起始零点开始，两段启动子片段长度分别为:－1019～＋76（1096bp）和－189～＋76.上游引物分别为Fw1：gggtaccgggagcacgggaactagc和Fw2：gggtaccccacccttgctgttctga；下游引物Rv：aagcttggagaatgggcaaagcgaaa.细胞培养及模板提取将HepG2细胞用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃，50mL/LCO2的孵箱中培养.收集对数生长期细胞约1×107，以细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA.启动子基因的克隆以HepG2细胞基因组DNA为模板，用Fw1为上游引物、Rv为下游引物，经预实验选择94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min,共30个循环，获得一长度为1096bp的片段，命名为Id1p1；选用Fw2为上游引物、Rv为下游引物，经预实验选择94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s,共30个循环，获得一长度为266bp的片段，命名为Id1p2.用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳获得2条鉴定条带，大小分别约为1100bp和260bp.参照试剂盒的操作说明回收并纯化.启动子载体的构建与测序将荧光素酶报告基因pGL3 enhancer载体分别行KpnⅠ和HindⅢ双酶切，回收.同时将之前回收的PCR产物同样经KpnⅠ和HindⅢ双酶切及琼脂糖凝胶电泳，分别回收约1100bp和260bp条带.使之分别在T4连接酶的作下与pGL3 enhancer载体以3∶1和10∶1的浓度比于16℃连接12h，使Id1p1和Id1p2基因序列插入无启动子的pGL3 enhancer载体中.以低温CaCl2法转化感受态细菌，涂布于含氨苄青霉素（100mg/L）的固体LB培养皿上，12h后挑取单克隆菌落，以质粒小量提取试剂盒提取质粒.行KpnⅠ和HindⅢ双酶切并测序鉴定阳性克隆的重组质粒.最终构建成重组报告基因载体Id1p1/PGL3和Id1p2/PGL3.启动子载体转染肝癌HepG2细胞系将两种重组质粒、空载体pGL3 enhancer和内参照pRL TK载体转化的阳性菌株，在LB培养基中37℃摇床培养过夜，按质粒提取说明分别提取Id1p1/pGL3，Id1p2/pGL3、空载体pGL3 enhancer 和pRL TK的DNA，经紫外分光光度仪测定A260nm值.按照LipofectaminTMReagent脂质体转染系统说明，于转染前1日将细胞接种于24空板，5×104/孔，第2日当细胞约90%融合时，每孔分别定量加入Id1p1/pGL3μg，PRL TK内参照载体100ng，LipofectaminTM5μL和无血清培养基200μL.6h后换含FBS100mL/L的RPMI1640，培养18h.报告基因活性的检测瞬时转染24h后收集、裂解细胞，离心取上清，用Dual LuciferaseReporterAssaySystem 在TD20/20荧光照度计上测定裂解上清内Luc活性,计算FireflyLuc/RenillaLuc的比值，并以空载体pGL3 enhancer转染细胞作对照，进行比较以判断Id1p1和Id1p2启动子活性.2结果目的基因的克隆及测序以肝癌细胞HepG2基因组DNA为模板，分别克隆出两段Id1启动子，分别为1096bp的Id1p1和266bp的Id1p2（图1）.图1PCR产物琼脂糖凝胶电泳略启动子报告基因载体酶切及测序鉴定回收经KpnⅠ和HindⅢ双酶切得到的Id1p1和Id1p2两重组质粒和pGL3 enhancer载体的相应条带，经T4连接酶连接后转化感受态细菌.再经KpnⅠ和HindⅢ酶切后，两种重组质粒分别释放出1096bp和266bp大小的片段（图2）.测序结果亦证实两段均包含Id1启动子序列.表明包含不同长短的Id1启动子报告基因载体构建成功.（作者：3COME未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系service@立即删除）。
PAI—1基因的研究
龚国胜
【期刊名称】《国外医学：输血及血液学分册》
【年(卷),期】1991(014)004
【摘要】PAI-1(Plasminogen activator Inhibitor-1)即内皮细胞型纤溶酶原激活物抑制因子属于丝氨酸蛋白酶抑制物(Serpin)。
它是一种由379个氨基酸残基组成的糖蛋白,分子量52kd,等电点4.5～5.5。
自从Loskutoff等于1977年发现人内皮细胞培养液中存在PAI-1以来,人们已从血浆、平滑肌、胎盘、纤维肉瘤细胞和黑色素瘤细胞提纯PAI-1。
【总页数】4页(P203-206)
【作者】龚国胜
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】Q71
【相关文献】
1.PAI-1及其基因启动子区4G/5G基因多态与多囊卵巢综合征的研究进展 [J], 孙林;关咏梅;傅松滨
2.纤维蛋白原基因β455G/A、PAI基因4G/5G多态性与下肢深静脉血栓的相关性研究 [J], 张秀华;陈云书;侯小华;李桂芹
3.针对PAI基因的小干扰RNA特异性调节PAI及tPA表达的实验研究 [J], 侯旭晖;杜建时;尹健;张静菊
4.PAI-1基因启动子区4G/5G基因多态和Enos第4内含子a/b基因多态与糖尿病肾病的相关性研究 [J], 李长贵;杨乃龙
5.花背蟾蜍Paired box 6 variant基因与Paired box 6基因的功能异同与具体功能位点的探究 [J], 王志浩;纪羽;杜少博;张颖;高岚;
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人脂联素基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建路玲玲;宰军华;崔琳;李强;张莎莎;金小琴【摘要】This study was designed to clone human adiponectin (AD) promoter and construct its luciferase reporter vectors. Total DNA was extracted from human leukocytes and used for amplifying two types of human AD promoter using polymerase chain reaction (PCR) technique. The amplified fragments were inserted into pGL-3 basic vector to construct two types of pGL-3-AD promoter plasmid containing 1.1 kb and 2.1 kb of human AD promoter. The sequence of two recombinant plasmids was determined using gene sequence analysis. The results showed that the recombinant plasmid pGL-3 basic containing human AD promoter was correctly constructed. The sequence was verified to share 99.6% homology with the sequence published at GenBank. It was concluded that the luciferase reporter vector containing human AD promoter is successfully established, which is useful in biolumines-cence imaging technology in vitro.%目的:克隆不同长度人脂联素基因(AD)启动子片段,构建含人AD启动子片段的荧光素酶报告基因载体并进行测序鉴定.方法:利用PCR技术从人全血基因组DNA中扩增出AD启动子片段,经纯化酶切后克隆入载体pGL-3 basic中,形成重组质粒,筛选阳性克隆进行测序,并与GenBank比对.结果:从人全血基因组DNA中PCR扩增得到1.1 kb和2.1 kb AD启动子片段,构建2种报告基因载体,将其命名为AD promoter1.1-pGL-3 basic和AD promoter2.1-pGL-3 basic,经测序证实所插入的目的片段与GenBank检索的人AD启动子序列99.6％匹配.结论:成功构建了含人AD启动子片段的报告基因载体.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2013(000)001【总页数】7页(P55-61)【关键词】脂联素基因;启动子;克隆;人基因组DNA;荧光素酶报告基因【作者】路玲玲;宰军华;崔琳;李强;张莎莎;金小琴【作者单位】河南中医学院第一附属医院郑州450000;河南中医学院第一临床医学院郑州450003【正文语种】中文近年来实验研究表明，脂肪组织是一个代谢活跃、功能复杂的内分泌器官，可以产生多种具有生物活性的物质，如脂联素（Adiponectin,AD）、瘦素（Leptin）、纤溶酶原激活物抑制因子（Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1）、抵抗素（Resistin）、白介素 6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子α（Tumournecrosis factor-alpha,TNF-α）等，统称为脂肪细胞分泌因子（Adipokines,ADS）。
一鼓作气！荧光素酶报告基因解决方案01双报告基因检测操作流程02单报告基因检测操作流程二GeneCopoeia 荧光素酶报告基因解决方案1.荧光素酶载体构建GLuc-ON™转录响应（TRE）克隆Genecopoeia 提供 GLuc-ON™ 转录响应 (TRE) 克隆，用于在哺乳动物细胞系上进行快速灵敏的信号通路分析。
这些克隆使用分泌型的 Gaussia Luciferase (GLuc) 作为报告基因，通过灵敏而显著的荧光反应，检测特定信号通路对环境刺激物或其他实验操作的生物应答。
GLuc 基因是一个分泌型的蛋白，无需裂解细胞就能从培养基中获得实验样本进行快速方便的检测。
GLuc-ON™启动子报告克隆GeneCopoeia 提供预制和定制的 GLuc-ON™ 启动子克隆，包括单报告基因载体系统和双报告基因载体系统。
单报告基因载体系统以Gluc 作为启动子的报告基因；双报告基因载体系统以Gluc 作为启动子报告基因，以分泌型碱性磷酸酶（SEAP）作为信号标准化的内参，可在活细胞中对超过 20,000 种人和 18,000 种小鼠启动子进行实时活性分析。
miRNA 3' UTR 克隆GeneCopoeia 提供两套 3'UTR 报告载体。
在 pEZX-MT05 载体中，我们将3' UTR 序列（来源于公开的基因序列数据库）插入到Gaussia 荧光素酶报告基因下游，在哺乳动物细胞中由 SV40 启动子驱动转录生成Gaussia 荧光素酶（Gluc）和3' UTR 靶标序列的嵌合mRNA，因此无需裂解细胞实时监测Gluc 的表达，研究mRNA-miRNA 的相互作用。
在相同载体（pEZX-MT05）上带有分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因。
CMV 启动子驱动转录的SEAP 作为同质粒内的对照，这种双报告系统可以对多样本常规转染进行精确比较。
pEZX-MT06 是 Firefly/Renilla 双荧光素酶报告载体。
荧光素酶报告结果分析1. 引言荧光素酶是一种广泛应用于生命科学研究中的酶类。
它具有高度灵敏性和特异性，使得荧光素酶报告成为了许多实验室中常用的技术手段。
本文将对荧光素酶报告的结果进行分析，帮助读者更好地理解并应用这一技术。
2. 荧光素酶报告的基本原理荧光素酶报告是一种利用荧光素酶（Luciferase）催化底物产生荧光信号的技术。
荧光素酶在存在氧气和ATP的条件下，将底物荧光素（Luciferin）氧化，产生相应的荧光信号。
通过测量这种荧光信号的强度，可以间接地推断出目标物的含量或活性。
3. 数据收集和处理在进行荧光素酶报告实验时，通常需要进行数据的收集和处理。
首先，需要设计实验方案，包括目标物的选择、实验组和对照组的设置等。
然后，在适当的条件下，对样本进行处理并收集荧光素酶报告的数据。
数据处理的步骤包括：首先，将实验中获得的荧光素酶报告信号转化为对应的目标物含量或活性。
这一步骤通常需要利用标准曲线或已知标准物质进行定量分析。
其次，对数据进行统计学分析，比较不同组别之间的差异性和显著性。
最后，根据实验的目的，对结果进行解释和总结。
4. 结果分析根据荧光素酶报告的结果，我们可以得到以下几个方面的信息：4.1 目标物的含量或活性荧光素酶报告的结果可以反映目标物的含量或活性水平。
通过比较不同组别之间的荧光素酶报告信号强度，可以推断目标物的相对含量或活性的差异。
比如，在荧光素酶报告的实验中，我们可以比较不同药物处理组的荧光素酶信号强度，从而推断不同药物对目标物的影响程度。
4.2 实验的稳定性和重复性荧光素酶报告的结果还可以反映实验的稳定性和重复性。
通过比较同一组别内的多个重复实验结果，可以评估实验的稳定性。
如果不同重复实验之间的结果变异较小，则说明实验具有较好的重复性。
4.3 相关因素的影响荧光素酶报告的结果还可以帮助我们了解其他因素对目标物含量或活性的影响。
比如，在荧光素酶报告的实验中，我们可以同时检测多个因素对目标物的影响，并通过对比结果来评估这些因素的重要性和作用机制。
