加湿器在石蜡切片中的应用

制作石蜡切片的常见问题及处理石蜡切片是组织学和病理学的主要实验方法,也是临床中观察病理变化的重要手段,为教学、科研和临床诊断做出了卓越贡献。

实践发现,切片制作过程中常常由于多方面的原因遇到困难,甚至导致制片失败。

本文将对制作石蜡切片过程中的常见问题和处理方法作重点介绍。

1切片不成带[1]常见原因:①切片刀不够锋利。

②切片刀与蜡块的角度不当。

③蜡块四周留蜡边太少。

④石蜡硬度过大,黏度不够。

解决方法:①重新磨刀。

②调整切片刀的角度。

③可重新包埋或将蜡块四周熔化,再放入包埋框中补蜡,修理蜡块时组织块周围保留的石蜡以2mm左右为宜。

④蜡块过硬可适当加些蜂蜡,或更换熔点较低的石蜡重新包埋。

⑤将蜡块放入冰箱内延长冰冻时间,然后迅速切片。

2切片弯曲常见原因:①组织成分及形状不规则。

②蜡块上下或左右两边不平行。

③蜡块与切片刀刀口不平行。

④切片刀各处的锋利程度不一致。

解决方法:①修整组织块时,注意修切整齐,切成方形或矩形,尽量不要切成三角形[2]。

②将蜡块四边反复修平对称。

③调节蜡块夹持器,使其与切片刀平行。

④移动切片刀,更换刀口位置。

⑤使用负离子发生器直吹切片处可防切片卷曲[3]。

3切片上出现裂纹常见原因:①切片刀上有小缺口,或刀口不平整。

②刀口上粘附有细微纤维(如毛发、纸或布丝等物。

③组织过硬变脆(如凝血块、胶冻样物质、囊腺瘤、甲状腺、腺瘤等[4]。

④组织中可能含有较硬之物质,如固定液之结晶石灰质。

⑤裱片的水温太高。

⑥包埋时石蜡冻结太慢。

解决方法:①切片刀某处有缺口,可调换刀口部位或重新磨刀。

刀口上缺口过多且不平整,可先将刀锋垂直在磨刀石上轻轻磨数次,然后按常规磨刀。

②擦净刀口。

③适当减少脱水、透明、浸蜡时间。

④组织中硬性物质太多,则不宜用。

⑤裱片的水温以45℃左右为宜。

⑥包埋时待蜡块周围凝结一层,即放入冷水中。

4切片厚薄不均常见原因:①脱水、透明、浸蜡过度、时间过长、温度过高[4]。

②蜡块太大,过硬,转动时刀刃受震动。

石蜡切片的注意事项
在进行石蜡切片的过程中，需要注意以下事项：
1.安全防护：切片过程中，使用刀片和切片机等工具时要注意安全，避免划伤皮肤，最好佩戴手套和护目镜等防护装备。

2.样本处理：样本在进行切片前需要进行固定和处理，以保证切片的质量和准确性。

样本可以通过化学固定、冷冻切片等方法进行处理。

3.刀片选择：选择合适的刀片进行切片，刀片应该锋利且无缺损，这样可以得到光滑且质量好的切片。

4.切片机设置：切片机的切片速度、角度和厚度等参数需要根据具体样品的要求进行调整，以保证切片的质量和完整度。

5.温度控制：石蜡切片需要在适当的温度下进行，通常选择切片温度为55-60摄氏度，这样可以使得石蜡软化并保持切片的完整性。

6.切片角度：切片时要保持合适的角度，通常选择与组织纵轴垂直的切片角度，以得到组织的完整截面。

7.切片保存：切片完成后，应及时将切片保存在干燥、防尘和光线较弱的条件下，
可使用干燥的石蜡片或切片盒进行保存。

8.切片质量检查：切片完成后，需要进行切片质量的检查，如检查切片的平整度、切面的清晰度和组织结构的完整性等。

9.操作规范：进行石蜡切片时，需要严格按照操作规范进行，避免操作中出现不当的操作或者疏忽等导致切片质量的下降。

超声波加湿器在石蜡切片中的应用杨江辉,余　琦,周会芹,宋业颖(解放军总医院第二附属医院病理科,北京100091) 【摘要】　目的　探讨消除组织石蜡切片时产生静电的有效方法。

方法　在组织石蜡切片时,用普通家用超声波加湿器消除切片时产生的静电。

结果　使用超声波加湿器后,切片时静电吸附现象消失。

结论　超声波加湿器能有效消除石蜡切片时产生的静电,确保切片质量、提高工作效率,保护工作人员的身体健康,营造舒适的工作环境。

【主题词】　超声波;　加湿器;　石蜡切片【中图分类号】　R363.6 【文献标识码】　B 【文章编号】　1672-3511(2009)12-封三-01 随着科学技术的不断发展,疾病的诊断手段也日趋先进。

但病理诊断工作仍占重要地位,特别是对肿瘤的诊断更具决定性意义[1]。

北方的冬、春季节相对干燥,湿度较低。

在病理科进行组织石蜡切片时,由于气候干燥及相互摩擦易产生静电,严重影响了切片的质量及切片速度。

为改善这种状况,我们采用亚都超声波加湿器来增加切片机周围的湿度,防止静电的产生,效果明显。

此法简单、有效,利于工作人员身体健康。

1　材料与方法1.1　材料　普通家用小型加湿器:亚都YC-D207型超声波加湿器,使用前加入超纯水。

纯水机:基因研究型超纯水机,重庆颐洋企业发展有限公司。

温-湿度表:JWS-A5型温湿度表,北京亚光仪器有限责任公司,温度:-10～40℃,湿度:10%～90%RH。

1.2　方法　在进行石蜡切片前,将亚都超声波加湿器放于切片机旁,打开至中档,然后进行切片。

温-湿度表示切片室内空气湿度由22%RH增加至65% RH,切片时不再出现因气候干燥和摩擦而产生的静电吸附现象。

2　结果使用超声波加湿器后,切片时静电吸附现象消失。

切片不再粘于毛笔、镊子、切片刀上,组织碎屑及灰尘不再被工作人员吸入。

3　讨论超声波加湿器是利用超声波的空化作用将水变成雾化水粒,喷洒在居室或工作房间内,以达到增加空气湿度的目的[2]。

石蜡切片免疫荧光实验步骤1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。

2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。

此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。

3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体流失。

4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗同源血清封闭）。

5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。

6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。

7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。

8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。

9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。

10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。

石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。

然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。

固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。

2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。

首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。

接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。

最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。

3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。

使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。

切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。

4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。

不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。

修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。

5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。

将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。

然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。

接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。

6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。

使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。

注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。

2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。

3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。

4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。

5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。

石蜡切片免疫组化实验方法预处理：1.收集组织样品：选择实验需要的组织样品，如病变组织或动物组织，固定在4%的中性缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24小时。

2.脱水：将固定的组织样品进行脱水处理，使用升级的乙醇浓度，如70%乙醇、85%乙醇和95%乙醇各浸泡5-10分钟，然后在无水乙醇中浸泡2-3次，每次浸泡时间为10分钟。

3.渗透剂处理：将组织样品置于染料渗透剂（如苯酚甲醛、苯酚）中进行渗透处理。

渗透剂的选择根据实验需要的类型来确定。

4.包埋：将已经渗透处理的组织样品放入合适大小的模具中，加入石蜡进行包埋，通常使用两次石蜡浸渍15-20分钟，然后定位标本，放入包埋模具中。

切片：1.切片机调节：根据具体的切片机和刀片的不同，调节适当的角度和切片速度。

2. 切片：将包埋好的组织块放入切片机的切片盘中，以适当的角度切出厚度约为4-6um的石蜡切片，切片时需要保持刀片的清洁，避免刮伤组织。

3.切片回收：使用刀片回收装置将切下的切片轻轻回收至水中，再将切片转移到预处理盒中。

染色：1. 去蜡：将石蜡切片放入脱蜡溶液（如xylene）中进行脱蜡处理，每个浸泡站点持续3-5分钟。

2.脱水：将石蜡切片从脱蜡溶液中取出，放入浓度递减的乙醇溶液中，分别浸泡5分钟，如95%乙醇、70%乙醇和纯水。

3.抗原修复：为恢复组织切片的抗原表位，可以选择酶消化、高压加热或微波处理等方法来进行抗原修复，常用的抗原修复方法包括热处理和酶切法。

4.屏障消除：为了阻止非特异性结合，需要进行屏障消除，使用5%非脂干奶粉或血清进行预阻断，通常需要在37°C孵育1小时。

5.一抗处理：将相应的一抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在4°C下孵育过夜。

6.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。

7.二抗处理：将荧光标记的二抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在室温下孵育1小时。

8.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。

石蜡切片的制作标准化操作流程1.取材固定1)取材必须新鲜，组织离体后迅速割取组织块，并随即投入固定剂福尔马林中。

切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。

2)固定完毕，用水冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。

2.脱水脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水，各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。

需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。

3.二甲苯透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。

透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。

将组织块先放入纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，。

透明时间一般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。

4.透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在60℃左右。

透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。

纯石蜡应处理2-3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15-30min。

透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。

包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。

具体做法是；先准备好纸盒，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。

5.切片方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。

石蜡切片实验报告石蜡切片是一种常用的组织学实验技术，已经被广泛应用于医学、生物学等领域。

本实验报告将详细介绍石蜡切片实验的步骤、原理以及实验中可能遇到的问题和解决方案。

第一部分：实验步骤石蜡切片实验的步骤主要包括标本制备、石蜡浸渍、切片和染色几个关键环节。

首先，我们需要收集适当的组织标本，如动物器官或植物组织。

这些标本需要经过固定处理，通常使用福尔马林进行固定，然后进行脱水和透明化处理，最终被浸渍进入石蜡中。

在石蜡浸渍的过程中，我们需要将标本逐渐浸入温度逐渐升高的石蜡中，以使其充分浸渍并软化。

这个过程中需要注意温度的控制，同时还要避免气泡的产生。

一旦标本被完全浸渍在石蜡中，我们可以使用石蜡切片机进行切片。

在切片过程中，我们需要调整切片机的切片厚度，通常为4-6微米。

此外，为了得到较好的切片质量，我们还需要确保刀片的锋利度和切片机的切片速度适当。

切片完成后，我们需要将切片置于载玻片上，并进行染色处理。

染色可以提高组织的对比度，使细胞和组织结构更加清晰可见。

常用的染色方法包括血液学染色、核染色和生物标记染色等。

第二部分：实验原理石蜡切片实验的原理是基于石蜡的高渗透性和易于切割的特点。

通过浸渍和固化过程，标本会充分浸泡在石蜡中，使其变得坚硬而易于切割。

切片机通过旋转刀片来切割标本，形成薄而均匀的切片。

石蜡切片实验的目的是为了观察和研究细胞和组织的结构。

通过切片和染色，我们可以清晰地看到细胞的形态、组织的排列以及细胞内的细胞器结构。

这对于研究疾病的发生机制、药物治疗的效果评估以及生物学基础研究等方面都具有重要意义。

第三部分：实验问题与解决方案在石蜡切片实验中，可能会遇到一些常见的问题，如切片不均匀、切片断裂或组织变形等。

这些问题可能会影响实验的结果和观察效果。

为了解决这些问题，我们可以在实验过程中采取一些措施。

首先，在标本制备过程中，我们可以控制好固定时间，避免过长或过短的固定时间导致的组织变形。

其次，在切片机操作过程中，我们需要确保刀片的锋利度和切片机的切片速度适当，以避免切片不均匀或切片断裂的问题。

一、石蜡切片1. 固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。

凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。

同时能使组织硬化，有利于切片的进行。

2.脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。

固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。

3.透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。

纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。

材料块在透明剂浸渍过程称透明。

4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。

先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。

5.包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。

6.切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。

通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。

7.贴片与烤片：一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。

8.切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。

9.染色：经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。

实验操作简单。

免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。

二、冰冻切片1.取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

2.速冻：1）将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。

2）如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3）当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

加湿器对病理切片质量的提升作用-病理学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——在常规病理切片的制作过程中，组织蜡块切下的蜡片容易出现干燥、碎裂，严重影响切片质量和制片速度[1].目前尚无统一方法，有采用湿纸团擦拭蜡面的方法来湿化蜡片；也有采用哈气的方法，用呼出的水汽来湿化蜡面[2].但是，以上方法影响切片效率、易导致标本污染。

所以，临床迫切需要一种既能保证工作效率同时又能提高切片质量的加湿方法。

我们通过联合使用超声波加湿器及自制的切片机加湿套装对蜡片进行加湿，期望通过该方法改善制片质量，同时保证工作效率。

1 材料与方法1. 1 材料搜集2014-01-2014-05 间协和医院病理科外检标本共100 例，其中肝组织16 例，脑组织13 例，甲状腺组织45 例，淋巴结组织26 例。

所用器材：樱花脱水机，LeicaRM2235 型切片机，中国亚都牌SC-EB35B 型超声波加湿器，羽毛A35 型刀片，塑料软管一段，塑料载玻片盒盖1 个。

1. 2 方法1. 2. 1 标本处理100 例标本均经过4% 中性甲醛固定，在樱花脱水机中经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡浸泡、常规包埋。

共制作蜡块530 块，其中甲状腺组织174 块，肝组织105 块，脑组织43 块，淋巴结组织208 块。

1. 2. 2 蜡块切片及标本分组530 块蜡块均使用同一台切片机，切片厚度3 m; 每一蜡块切片2 次，第1 次切片时采用加湿套装进行加湿处理，该组切片为加湿组；第2 次切片时不作任何处理，该组切片为对照组。

整个操作过程中，均由经验丰富的同一技师操作。

1. 2. 3 加湿器组加湿器组在切片同时，采用超声波加湿器配合切片机加湿套装在切片过程中从始至终对蜡块进行加湿；而对照组直接切片。

1. 2. 4 切片机加湿套装制作及使用方法将塑料载玻片盒盖较短的一侧去掉（图1）,将塑料软管的一头插入加湿器出气孔中，另一头放置在切片机刀头的正上方（图2）,将制作好的盒盖覆盖在软管头上（图3）,在23 ~ 25℃的室温下，加满加湿器水箱，打开开关，调节加湿器喷雾量旋钮使加湿器喷出的水雾完全覆盖所要切的蜡块，即可进行切片（图4）.1. 3 结果判定参照HE 切片的规范技术标准[3]判定为合格。