植物组培过程中污染产生的原因及防治措施

农家参谋农业研究-54-NONG JIA CAN MOU植物组培污染的原因及防控要求王鑫1闫佳2（1.河南林业职业学院，河南洛阳，471000；2.安阳市农作物良种试验示范站，河南安阳，455000）【摘 要】植物组培技术属于一门新兴技术，在科学研究及生产应用上的地位非常重要。

本文从材料带菌、实验操作和培养环境带来的污染等方面分析了植物组培污染的原因，提出了具体的防控要求。

【关键词】植物组培污染；原因；防控1 植物组培污染的原因植物组培污染，主要指组培的时候，由于培养的温度、湿度及营养条件等刚好符合微生物的生产需求，植物组织材料可能会在这个环节出现培养体系污染问题。

一般来说，植物组培污染都是在材料表面或者附近等部位，污染痕迹各不相同，是影响植物组培种苗是否能够成功的主要因素。

通常情况下，植物组培时，跟霉菌污染相比，细菌污染的比例更高一些，大约占百分之八十。

在细菌污染过程中，情况更为复杂的属于内生细菌污染。

产生污染的污染源比较多，有真菌、病毒，还有植物病原细菌等。

以真菌为例，真菌的来源是空气，当袍子在合适的环境中落下能够迅速的繁殖，从而对组培容器产生污染；以植物病原体细菌为例，一般分布在外植体的表面部门，也有分布在内部的，而病毒基本就是在植物内部，需要有传播载体，其中细菌污染最为严重。

1.1 材料带菌在植物组培污染中，一个不可避免的污染途径就是材料带菌，这跟生长环境及取样时间等都有关系，同时也跟外植体的消灭细菌的方法有一定的关联。

通过深入的分析可以发现，一般来说从一种外植体中分离出来的杂菌种类有数十种，在热带植物中表现的最为明显。

而随着植物材料年龄的增加，其健康度在减小，加剧了组培污染。

就内源菌污染来说，因为其污染的来源是外植体材料内部的微生物，一般的表面消毒是不能被消灭的，是随着材料带入从而产生危害。

1.2 实验操作和培养环境带来的污染这种污染的表现主要在四个方面：第一个方面，无菌室灭菌操作不到位，还有的是超净工作台滤出来的空气中带有细菌；第二个方面，培养基细菌消灭的不彻底；第三个方面，操作中可能导致的交叉污染；第四个方面，人员操作过程中可能产生的污染。

植物组织培养中产生污染的原因1、外植体①年龄、种类和大小。

成年植株带菌多；生理年龄老的材料带菌多；杂菌和内生菌多的外植体、有病虫害的植株，均易污染；室外生长的材料带菌多；表面有泥土的材料、地下器官均带菌多；表面积大的材料比表面积小的材料带菌多[1-2]。

②取材时期和部位。

雨季菌类繁殖旺盛，此时材料带菌多；阳光最强时紫外线较强，杀菌效果好，此时材料带菌较少；选取了不清洁、生长不旺盛部位的材料带菌多。

③灭菌效果。

外植体灭菌是组织培养的关键，灭菌效果直接决定了组织培养的成败，灭菌方法和灭菌剂处理不当导致灭菌效果差，使外植体带菌。

2组织培养过程中各技术环节操作不规范①培养基。

使用长菌的母液配制培养基；培养基pH值高、添加的有机成分均可导致细菌污染；培养基分装好后没有及时封口或封口后没有立即灭菌；培养容器口没有封严导致灭菌后细菌和真菌孢子再次进入培养容器使培养基污染；封口用的塑料盖、封口膜长时间在日光灯照射下易老化、破裂，导致密封性差，不慎使用后可能导致培养基污染；橡皮筋长时间在日光灯照射下也易松动、断裂，杂菌可能趁机进入培养容器；灭菌方法不当导致培养基污染；灭菌时间过短导致培养基灭菌不彻底；灭菌时间达到后立即打开灭菌锅，导致容器内压力差过大，使外部杂菌有可能被倒吸入容器中；过滤较多溶液后，滤膜过滤效果较差，使过滤后的溶液有菌，加入培养基后造成污染。

②培养容器和接种器具。

培养容器不清洁；培养容器被污染后灭菌不彻底，再次使用时导致污染；高压灭菌锅或烘箱内培养容器、接种器具装得过满，影响灭菌效果；培养容器、接种器具灭菌时间过短导致灭菌不彻底；灭菌结束后立即打开高压灭菌锅或烘箱，强烈的冷热对流会导致冷空气被吸入包扎层内而重新造成污染带菌。

③接种人员。

过长指甲；双手未清洗干净；衣服和头发有很多灰尘，接种时不换拖鞋、接种服、帽子和口罩；不慎将已污染的培养材料拿入超净工作台，转接后再次污染；培养容器中接种的培养物过多；超净工作台上物品摆放过多、过高使气流被挡住，导致灭菌效果差；接种时说话或咳嗽会呼出大量细菌；操作时手超出工作台面；手接触培养容器边缘，放在器皿、接种器械上方致使微生物落入培养容器中；打开培养容器的塞子、盖或封口膜时空气进入带来灰尘；接种过程中器械被手或带菌材料污染后未经消毒，再次使用后又污染了材料；没有在超净工作台下风方向操作而使菌类随风飘落到容器中[3]；中途离开超净工作台后马上又继续接种，将培养基、器械等物品拿入超净工作台继续接种而带入灰尘，顺风飘入器皿。

浅谈植物组织培养中的污染问题与防治措施李建忠（广西职业技术学院农业技术工程系02应生班）摘要：植物组织培养过程中的每一个环节，都应该谨慎操作，否则随时都有可能造成污染从而影响到实验的成功与否和大规模生产的顺利进行。

污染通常是由于培养容器，操作器械和培养基的不干净或消毒灭菌不彻底；接种环境和培养环境不清洁；操作人员操作不慎以及培养材料消毒不过关或携带内生菌等因素引起的。

本文将针对以上几方面介绍相关的防治措施，来减少污染问题的发生。

关键词：组织培养，污染，防治措施，消毒灭菌。

植物组织培养过程中，污染问题是一个普遍存在的现象。

能否很好地解决污染问题，关系到实验的成功与否和大规模生产的顺利进行。

所谓污染是指在培养过程中由于外界真菌，细菌或培养材料的内生菌所侵染，而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。

污染来源主要分为外界污染和内部污染两种。

具体原因可分为：①培养容器、操作器械和培养基的不干净和消毒灭菌不彻底；②接种环境和培养环境不清洁；③操作不谨慎；④外植体消毒不过关；⑤培养材料携带内生菌。

针对以上污染源，现将各相关防治措施分别介绍如下：1． 培养容器、操作器械和培养基不干净与消毒灭菌不彻底1．1培养容器的清洗植物组织培养过程中，用于培养的容器有试管、三角瓶、培养瓶和培养箱等。

目前主要以培养瓶的使用为主。

对于培养瓶的洗法，根据桂林莱茵应用生物科技有限公司和加好生物工程有限公司的经验，先将瓶内的培养基去掉，然后置于淡洗衣粉水中浸泡一定时间，再在浓洗衣粉水中涮洗。

涮洗时要认真，瓶内瓶外都要涮洗到不能遗漏任何一处。

最后在流动的自来水下将残留的洗衣粉泡沫冲洗掉。

洗后的瓶子应明亮，内壁水膜均一，不挂水珠。

将洗干净的瓶子倒放在盘中或筐内，滤干水后，置于干净、明亮、干燥的地方备用。

需要注意的是，应将未污染的与污染的分开来洗。

先洗未污染的，再洗污染的。

并且分开放，以免造成交叉污染，而加重下一步的灭菌工作。

而对于瓶盖，也应严格的用洗衣粉水来认真涮洗，凉干后与瓶子一起存放备用。

植物组织培养中产生污染的原因1、外植体①年龄、种类和大小。

成年植株带菌多；生理年龄老的材料带菌多；杂菌和内生菌多的外植体、有病虫害的植株，均易污染；室外生长的材料带菌多；表面有泥土的材料、地下器官均带菌多；表面积大的材料比表面积小的材料带菌多[1-2]。

②取材时期和部位。

雨季菌类繁殖旺盛，此时材料带菌多；阳光最强时紫外线较强，杀菌效果好，此时材料带菌较少；选取了不清洁、生长不旺盛部位的材料带菌多。

③灭菌效果。

外植体灭菌是组织培养的关键，灭菌效果直接决定了组织培养的成败，灭菌方法和灭菌剂处理不当导致灭菌效果差，使外植体带菌。

2组织培养过程中各技术环节操作不规范①培养基。

使用长菌的母液配制培养基；培养基pH值高、添加的有机成分均可导致细菌污染；培养基分装好后没有及时封口或封口后没有立即灭菌；培养容器口没有封严导致灭菌后细菌和真菌孢子再次进入培养容器使培养基污染；封口用的塑料盖、封口膜长时间在日光灯照射下易老化、破裂，导致密封性差，不慎使用后可能导致培养基污染；橡皮筋长时间在日光灯照射下也易松动、断裂，杂菌可能趁机进入培养容器；灭菌方法不当导致培养基污染；灭菌时间过短导致培养基灭菌不彻底；灭菌时间达到后立即打开灭菌锅，导致容器内压力差过大，使外部杂菌有可能被倒吸入容器中；过滤较多溶液后，滤膜过滤效果较差，使过滤后的溶液有菌，加入培养基后造成污染。

②培养容器和接种器具。

培养容器不清洁；培养容器被污染后灭菌不彻底，再次使用时导致污染；高压灭菌锅或烘箱内培养容器、接种器具装得过满，影响灭菌效果；培养容器、接种器具灭菌时间过短导致灭菌不彻底；灭菌结束后立即打开高压灭菌锅或烘箱，强烈的冷热对流会导致冷空气被吸入包扎层内而重新造成污染带菌。

③接种人员。

过长指甲；双手未清洗干净；衣服和头发有很多灰尘，接种时不换拖鞋、接种服、帽子和口罩；不慎将已污染的培养材料拿入超净工作台，转接后再次污染；培养容器中接种的培养物过多；超净工作台上物品摆放过多、过高使气流被挡住，导致灭菌效果差；接种时说话或咳嗽会呼出大量细菌；操作时手超出工作台面；手接触培养容器边缘，放在器皿、接种器械上方致使微生物落入培养容器中；打开培养容器的塞子、盖或封口膜时空气进入带来灰尘；接种过程中器械被手或带菌材料污染后未经消毒，再次使用后又污染了材料；没有在超净工作台下风方向操作而使菌类随风飘落到容器中[3]；中途离开超净工作台后马上又继续接种，将培养基、器械等物品拿入超净工作台继续接种而带入灰尘，顺风飘入器皿。

贵州农业科学2004,32(1):61~62Guizhou Agr icultur al Sciences新品种#新技术#新方法[文章编号]1001-3601(2004)01-0024-0061-02植物组织培养过程中的污染原因及控制措施赵佐敏,艾勇(贵州省安顺市农业科学研究所,安顺562109)Con tamin ation R eason an d its Control Measu re in Plan t Tissue CultureZHAO Zuo-min,AI Yong(Anshun Agricultural Institute,Anshun,Guizhou562109,China)[关键词]组织培养;控制污染[中图分类号]Q813.12[文献标识码]B根据笔者多年组培工作经验,将组培过程中可能出现的污染原因及控制措施总结如下。

1污染原因1.1培养材料带菌表现为接种后在外植体周围出现细菌、霉菌污染,可能原因是外植体消毒不彻底或外植体组织内部带有细菌、霉菌等杂菌。

1.2生产器具带菌生产器械、器皿带菌,包括镊子、剪刀、刀片、三角瓶、培养皿、封口膜等,超净台滤布不洁也会造成污染。

1.3培养基污染表现为接种前后培养基出现大量污染。

若菌落只存在于培养基表面且多为真菌时可能是由于瓶塞不严或扎[收稿日期]2003-09-23;2003-11-01修回[作者简介]赵佐敏(1967-),女,农艺师,从事园艺及生物技术研究。

贡献就越小。

结果表明,以双穗率最为重要,其对鲜食产量的影响最大,其次为行粒数,其余对产量贡献大小为:空秆率>出籽率>穗行数>株高>穗位高>千粒重。

株高、穗位高、千粒重3性状对产量的关联度虽然较小,但它们的作用发挥是通过其它性状表现的,对产量的影响也是不可忽视的。

2.2不同性状对产量的关联度不同,同一性状在不同品种中与产量的关联系数也不同从表2还可以看出:不同的性状对产量的关联度不同,同一性状在不同的品种中与产量的关联系数也不同。

植物组织培养的内生细菌污染问题植物组织培养是研究植物发育、代谢和遗传的重要手段之一。

然而，由于组培外植物材料易受微生物污染，因此内生细菌对植物组织培养的影响逐渐受到了研究人员的关注。

内生细菌指的是存在于植物体内且无害或有益的细菌。

它们往往与植物形成共生关系，参与植物的养分吸收、有机物分解、植物生长和发育等生理过程中。

然而，在植物组织培养中，内生细菌也会存在污染问题。

1. 影响植物生长和发育内生细菌在植物组织培养中污染会导致植物生长发育不良，严重时可导致死亡。

例如，一些内生细菌会导致植物细胞分裂和分化受到抑制，导致植物无法正常生长。

内生细菌还可能影响植物的养分吸收和使用，引起叶片发黄、萎缩等症状。

2. 影响植物代谢内生细菌的存在会改变植物的代谢途径，导致植物代谢产物的类型和数量发生变化。

这些变化可能会对植物的生长发育和药用成分产生影响。

例如，内生细菌可能改变植物次生代谢产物的合成途径，导致药材中活性成分的含量发生变化。

3. 影响实验结果的准确性和可重复性内生细菌污染可能会引起实验结果的误差，降低实验的准确性和可重复性。

如果实验中使用的植物材料受到内生细菌污染，实验结果可能会受到内生细菌的干扰，从而导致结果的不确定性和无法复制性。

1. 消毒试管、培养基和器具对需要使用的试管、培养基和器具进行充分的消毒处理，防止细菌污染。

消毒的方法可以选择热处理、化学消毒和紫外线消毒等。

2. 选择无内生细菌的植物材料在进行组织培养实验时应选择没有内生细菌的植物材料，以尽量避免内生细菌污染。

如果需要使用含内生细菌的植物材料，应该进行合适的处理，如洗涤、消毒和筛选等。

3. 建立污染检测体系建立污染检测体系，及时发现和去除污染物。

可以使用常规的菌落计数法检测细菌污染量，或者使用PCR技术检测特定的内生细菌存在情况。

总之，内生细菌污染是植物组织培养中的一个重要问题，需要研究人员重视并采取合适的措施进行预防和处理。

只有保证组织培养环境的卫生和无菌，才能保证实验结果的准确性和可重复性。

植物组织培养中常见的问题及防治措施1微生物污染问题1.1造成污染的原因（1）外植体材料本身带菌；（2）接种过程中接种工具灭菌不彻底或者交叉污染；（3）培养基灭菌不彻底。

1.2防治措施（1）外植体灭菌要彻底。

首先可以选择组织内部无菌材料；其次根据不同的材料选择不同的消毒剂和消毒时间；第三外植体消毒要细心，比如茎段消毒，经过消毒处理后，要把两端切去约0.5cm，这样就可以大大减少污染的概率。

（2）严格遵守无菌操作规程。

操作人员在进入接种室前一定要洗手，然后换上接种服，带上口罩，操作之前先用75%的酒精擦拭双手，接种工具要经常灼烧一保证不会带菌或者交叉污染。

（3）加抗生素。

在培养基中适当的加入抗生素可以有效防止污染。

（4）无菌培养环境。

培养室内要定期进行灭菌，可在室内装紫外灯，或者用高锰酸钾和甲醛熏蒸，或者利用其它的熏蒸剂进行灭菌。

（5）控制外植体的接种数量。

每个培养瓶中尽量接种少量的外植体。

（6）及时继代培养。

定期检查组培苗的生长情况，发现有污染苗头的组培苗及时转接到新鲜培养基上。

2褐变问题2.1影响褐变的因素（1）外植体材料的基因型；（2）外植体的生理状态；（3）培养基成分。

2.2防治措施（1）选择适当的外植体。

选择处于旺盛生长状态的外植体，对于容易褐变的植物注意对其不同品系的基因型进行筛选，选择褐变率较低的材料作为外植体。

（2）在培养基中加入还原性物质或者吸附剂。

在培养基中加入偏二亚硫酸钠、抗坏血酸、柠檬酸等抗氧化剂；或者加入0.1-1%的活性炭吸附培养物在生长过程中分泌的酚类、醌类物质，但是要注意活性炭也可以吸收培养基中的激素使之浓度降低。

（3）对培养材料进行预处理。

用抗氧化剂溶液进行预处理或者在接种前用无菌水洗净切口渗出的酚类物质。

（4）适当的培养条件。

在培养初期保持较低温度（15-20℃），可以降低PPO活性，防止酚类物质氧化，减轻褐变。

（5）其他措施，培养初期进行连续转接。

3玻璃化问题3.1影响玻璃化的因素（1）外植体材料；（2）培养的环境条件；（3）培养基成分，琼脂的浓度、碳源的种类及含量等；（5）封口材料。

1、植物组培污染防治问题（1）污染的来源。

植物组培污染主要是霉菌、细菌和酵母菌引起的污染。

霉菌和酵母菌在培养条件下生长快，很容易观察到，而细菌潜伏期长，植物组织一般不表现症状，所以很难在前期和肉眼观察到[1]。

国外有关学者认为细菌污染的来源主要有三个：一是材料内部灭菌处理不好，这样造成的污染占污染总数的1/3～1/2。

二是在正常的灭菌的条件下，内生菌能够存活，这样的污染占污染源的1/4。

三是来自寄生植物的污染占1/4～1/2。

同时认为有些植物的昆虫和螨虫的体表带有霉菌的孢子和细菌，在九、十月份是重要的污染源，因多种植物昆虫处在大量繁殖阶段，此时大量昆虫造成的污染源最易造成组培污染的严重发生。

近六年来，我们通过对猕猴桃、樱桃、托柄菝葜及大花非洲菊初级培养污染的研究中发现，高温、多雨的环境更有利于污染的发生，而且随着植物材料年龄的增长，植物材料的健康状况不断恶化，组培污染也会更加严重。

另外，外植体的状况，环境条件和操作过程也是引起污染的主要原因。

（2）抗生素对细菌污染的防治。

植物组培污染的控制取决于灭菌技术、灭菌设备、外植体年龄和环境条件等许多方面。

尽管在植物组培过程中尽量使无菌条件更完善，但是污染还是经常发生，甚至有时整个实验室的组培苗突出污染而全部死亡，这是无法挽回的巨大损失，因此人们对细菌污染研究的较多。

细菌污染的消除有些研究人员希望用抗生素防治，抗生素可以直接加入到培养基中，也可以用抗生素喷洒或浸泡外植体。

但植物种类不同，所用抗生素的种类、浓度和处理时间也不同，还有的抗生素对污染消除根本不起作用，因此必须对不同植物采用不同的抗生素的种类、浓度和处理时间进行实验探讨。

一般情况下，为消除革蓝氏阳性菌对有些木本植物污染茎段组培苗，可在培养基中加入氨中噻肟头孢菌素、四环素、利福平和多粘菌素B分别以25mg/L、25mg /L、6mg/L和6mg/L浓度的混合物，可使细菌完全被消除。

另外，用头孢菌素Ⅱ和链霉素消除某些观赏植物外植体中的内生菌也有非常明显的效果。

植物组织培养的内生细菌污染问题植物组织培养是一种重要的组织工程技术，通过该技术可以获得大量的无菌植物组织和植物体细胞。

在实际操作中，植物组织培养往往会受到内生细菌污染的影响，从而影响培养的质量和效果。

本文将从内生细菌的来源、危害以及防治措施等方面进行探讨。

一、内生细菌的来源内生细菌的来源主要包括原植物体、空气、培养基、操作人员和器皿等方面。

1.原植物体：植物体内生细菌是植物体内固有的微生物群落，它们在植物的生长发育过程中与植物体共生。

当进行植物组织培养时，如果植物体不经过充分的无菌处理，就会导致内生细菌的污染。

2.空气：空气中含有大量的微生物，尤其是在无菌操作环境不严谨的情况下，空气中的内生细菌会成为植物组织培养的一大污染源。

3.培养基：培养基中的原料和添加剂可能含有内生细菌，如果在制备培养基的过程中不严格控制无菌操作，就有可能导致培养基中含有内生细菌。

4.操作人员和器皿：操作人员和器皿是植物组织培养中最容易被忽视的污染源。

操作人员身上可能携带有内生细菌，而器皿则可能存在细菌残留。

内生细菌对植物组织培养会带来以下危害：1.影响培养的质量：内生细菌的污染会导致培养物生长缓慢、愈伤组织形成受阻，甚至无法正常生长。

2.引发病变：一些内生细菌可能对植物组织产生病原性，导致植物组织发生病变。

3.污染培养基：内生细菌对培养基中的营养成分进行消耗和改变，降低培养基的营养价值。

4.传播病原体：某些内生细菌可能携带病原体，进而通过培养物传播病害。

为了有效防治植物组织培养中的内生细菌污染，可以从以下几个方面进行处理：1.选择健康的原植物材料：在进行植物组织培养前，对原植物材料进行充分的无菌处理，确保原植物材料是无菌的。

2.严格控制无菌操作环境：在植物组织培养的整个操作过程中，要严格控制操作环境，确保操作场所、器皿、培养基、工具等都是无菌的。

3.培养基的选择和制备：选用高质量的无菌培养基原料，严格按照无菌操作要求制备培养基。