胰岛素钳夹实验技巧

高胰岛素-正常血糖钳夹试验1966年Andres依据葡萄糖胰岛素的负反馈原理设计了葡萄糖钳夹技术，经过不同的静脉通路，同时输入外源性胰岛素和葡萄糖，将血糖维持在设定的稳态，该技术可对胰岛素的分泌及作用进行定量分析。

1979年DeFronzo等对该技术作了详细研究并应用于人体,从此推动了葡萄糖钳夹技术在世界范围内的应用。

根据不同的研究目的，葡萄糖钳夹技术分为高血糖葡萄糖钳夹、正常血糖葡萄糖钳夹及低血糖葡萄糖钳夹等不同方法。

高胰岛素正常血糖葡萄糖钳夹技术由于其定量准确、可重复性好等优点，已成为评价机体胰岛素敏感性的“金标准”。

该平台由于能很好地排除内源胰岛素及升糖因素的影响，并能同时客观地反映外源胰岛素制剂的药代动力学(PK)/药效动力学(PD)特点，在研发新型胰岛素制剂以及仿制胰岛素产品时也成为目前国际公认的可靠方法。

在临床试验中，高胰岛素正常血糖葡萄糖钳夹技术是评价外源性胰岛素制剂的客观平台，该平台本身成功构建及良好维持是该技术的关键。

目前在药物研发中，使用高胰岛素正葡萄糖钳夹技术存在一些常见的问题，需要在今后应用该技术中加以关注。

2、关注要点2.1 成功建立高胰岛素正葡萄糖钳夹技术的条件：(1)形成稳定高胰岛素状态,达到完全抑制肝脏内源性葡萄糖输出的目的;(2)将血糖钳夹在正常水平,变异系数小于5%;(3)试验中内源性胰岛素分泌被抑制,升糖激素无明显释放。

2.2 高胰岛素正常血糖葡萄糖钳夹技术在临床试验中的应用需关注如下几点：2.2.1 血浆胰岛素保持优势浓度，充分抑制肝糖输出在规定时间内,使血浆胰岛素水平迅速升高并保持于优势浓度(一般接近100mU/L)，人体内胰岛素浓度高于生理水平时肝糖输出可以被充分抑制，葡萄糖输注率(GIR)方能真实反映外周组织的葡萄糖利用率,使得客观评价胰岛素制剂的药效动力学参数成为可能。

2.2.2 监测血糖间隔时间每5分钟监测一次静脉血糖值，根据血糖值调整葡萄糖液输注率,使受试者血糖值维持在目标值，变异系数应小于5%。

高胰岛素—正常血糖钳夹技术的护理及改进分析DOI：10.16658/ki.1672-4062.2017.05.007目的分析研究高胰岛素-正常血糖钳夹技术的护理及改进。

方法随机选取该院2016年10月—2017年1月期间收治的60例代谢综合征（MS）患者，按照入院顺序，分为实验组与常规组，各30例。

所有患者，均行高胰岛素-正常血糖钳夹试验，其中，常规组，行常规护理，实验组，实施经改进的护理方式，对比分析护理效果。

结果对比不良反应，实验组发生率为3.3%，常规组为16.7%，实验组显著低于常规组（P＜0.05）。

对比护理满意度，实验组显著高于常规组（P ＜0.05）。

结论高胰岛素-正常血糖钳夹试验中，采用经改进的护理方式，效果显著，值得推广。

标签：高胰岛素；正常血糖钳夹试验；护理；改进Analysis of Nursing and Improvement of Hyperinsulinism-Hyperinsulinemic-Euglycemic ClampZHENG Xiao-yanDepartment of Endocrinology，Jinan Central Hospital，Jinan，Shandong Province，260013 China[Abstract] Objective To analyze the nursing and improvement of hyperinsulinism- hyperinsulinemic-euglycemic clamp. Methods 60 cases of patients with metabolism syndrome admitted and treated in our hospital from October 2016 to January 2017 were randomly selected and divided into two groups with 30 cases in each according to the admission order，and all patients were treated with hyperinsulinism-hyperinsulinemic-euglycemic clamp，and the routine group adopted the routine nursing，while the experimental group adopted the improved nursing method，and the nursing effect was compared and analyzed. Results The incidence rate of adverse reactions in the experimental group was obviously lower than that in the routine group（3.3% vs 16.7%）（P＜0.05），and the nursing satisfactory degree in the experimental group was obviously higher than that in the routine group（P＜0.05）. Conclusion The effect of the improved nursing method in the hyperinsulinism-hyperinsulinemic-euglycemic clamp is obvious，which is worth promotion.[Key words] Hyperinsulinism；Hyperinsulinemic-euglycemic clamp；Nursing；Improvement胰岛素抵抗（insulin resistance ，IR）是導致代谢综合征（Metabolic syndrome，MS）的重要病因，目前，就国外内而言，高胰岛素—正常血糖钳夹技术是评价IR公认的“金标准”[1]。

胰岛素钳夹实验技巧实验步骤：1.试样准备：首先准备标准品的稀释溶液和样品的提取液。

将标准品按照一定的比例稀释至所需浓度。

对于样品，首先将胰腺组织等样品切成小块，并添加适量的提取缓冲液，然后使用超声波浸提或者机械粉碎等方法提取样品中的胰岛素。

2. 硝酸银试剂的制备：胰岛素钳夹实验主要是通过硝酸银试剂与胰岛素反应生成沉淀来间接测定胰岛素的含量。

制备硝酸银试剂的方法为：将1mol/L的硝酸银溶液缓慢滴加到相对浓度为0.1mol/L的硝酸铜溶液中，同时不断搅拌，直到沉淀停止产生。

然后将沉淀过滤并用水洗涤。

3. 血浆样品的处理：将标准品溶液和样品溶液分别加入不锈钢板槽内，然后加入硝酸钙溶液，使溶液的钙离子浓度为0.1mol/L。

接着，在实验前通过分光光度计测定样品和标准品的吸光度值。

4.实验操作：将溶液中的胰岛素与硝酸银试剂反应，生成测定物质，沉淀后使用胶体银试剂与捕获剂作用形成测定物，最后使用硫代硫酸钠溶液将测定物还原，产生测定物的比色反应。

根据标准曲线和样品的吸光度值，可以计算出样品中胰岛素的含量。

实验技巧：1.胰岛素钳夹实验需要使用无菌技术，以避免外源性胰岛素的干扰。

在实验操作前，必须充分清洁实验室器材和工作台面，并穿戴好实验手套和口罩等防护措施。

2.样品提取过程要小心轻柔，避免过度振荡或机械破碎。

这样可以避免样品中的酶释放，导致实验结果的偏差。

3.在实验过程中，注意各个试剂的储存和保护，要避免与空气长时间接触，以防止试剂变质。

4.实验操作时要严格按照实验步骤进行，在加入试剂时注意滴加的速度和剂量。

尤其是硝酸银试剂的滴加要缓慢并加入到硝酸铜溶液中，以避免出现不必要的反应。

5.在读取吸光度值时，应在相同的光路和条件下进行测量，并使用去离子水或提取液进行基线校准。

6.在计算胰岛素含量时，需要根据实验所用的标准曲线进行插值，以减少误差。

同时，注意将标准曲线的线性范围内的吸光度值与样品的吸光度值进行比较。

关于高胰岛素正常葡萄糖钳夹技术的建立【摘要】目的：建立能精确测定胰岛素敏感性的高胰岛素正常葡萄糖钳夹技术. 方法：应用高胰岛素��正常葡萄糖钳夹技术对10名正常体质量、正常糖耐量的健康志愿者进行方法学研究. 结果：钳夹试验开始后，血浆胰岛素浓度迅速上升并维持在100 mU/L左右，空腹血糖维持在正常水平(5.0 mmol/ L)，试验过程中内源性胰岛素和肝糖源输出得到完全抑制，血液升糖激素浓度 (包括皮质醇和生长激素) 与基础值相比无明显上升. 钳夹稳态期，葡萄糖输注率为(11.56±1.74) mg/(kg・min). 结论：高胰岛素�舱�常葡萄糖钳夹技术已成功建立. 在高胰岛素�舱�常葡萄糖稳态条件下，葡萄糖输注率等于机体的葡萄糖利用率，葡萄糖输注率可以作为评价组织对外源性胰岛素敏感性的指标.【关键词】胰岛素葡萄糖钳制技术胰岛素抗药性胰岛素敏感性0引言高胰岛素�舱�常葡萄糖钳夹技术 (hyperinsulinemic��euglycemic clamp) 是目前世界上公认评价机体胰岛素敏感性的金标准，已在基础及临床医学研究领域中得到广泛应用，并且已扩展应用于许多病理状态、药物或非药物防治措施的机制研究中. 建立和开展高胰岛素�舱�常葡萄糖钳夹技术对于糖尿病基础和临床研究具有重要意义，但由于此方法操作复杂、价格昂贵且费时，国内仅有数家医院开展此技术. 我院内分泌科自2006年引进葡萄糖钳夹系统以来，根据DeFronzo等［1］所建立经典钳夹技术的原理并结合国内外近年来的研究进展，成功建立了高胰岛素�舱�常葡萄糖钳夹技术.1对象和方法1.1对象10 (男5，女5)名正常健康志愿者，年龄27.0 ± 4.4 (23~37)岁，体质量指数20.3 ± 1.2 (19.2~23.2) kg/m2，无糖尿病、高血压病家族史，血脂谱正常，肝、肾功能及血尿酸浓度均在正常范围，未服用任何可能影响胰岛素敏感性的药物，口服75 g葡萄糖耐量试验均为正常糖耐量者 (按2003年ADA标准).试验前3 d受试者每日碳水化合物饮食不少于200 g，体质量保持稳定. 试验前向受试者解释试验的性质、目的及可能发生的不良反应，所有受试者均自愿参加试验并签署知情同意书.1.2方法受试者检查前空腹12 h，早8:00到达检查室，测量身高、体质量，排空小便后清醒静卧于检查床30 min后开始试验. 先分别于受试者双侧前臂行静脉穿刺，利用三通管组成2条静脉通道. 一侧用于输注胰岛素及200 mL/L葡萄糖液 (连接于Injectomat C IS和INCA��ST容积泵，德国Fresenius公司)；另一侧用于试验中采血 (将此侧前臂置于60℃恒温仪中，以保证静脉血动脉化［2］)，不采血时缓慢静滴生理盐水，采血前临时关闭输液器.钳夹开始10 min内以4 mU/（kg・min）速率输注人胰岛素溶液 (诺和灵R，40000 U/L，丹麦Novo Nordisk公司) 使血液胰岛素浓度迅速升高，随后110 min内以2 mU/（kg・min）速率持续输注. 在此期间每5 min测一次静脉血糖值(BIOSEN5030血糖分析仪，葡萄糖氧化酶电极法，德国)，根据血糖值调整200mL/L葡萄糖液输注率，使受试者血糖值维持在5.0 mmol/L左右. 每10 min采静脉血测定血清胰岛素浓度，每30 min测定血清C肽、皮质醇和生长激素浓度 (化学发光法，药盒购自天津德普诊断产品有限公司). 试验结束时收集试验期间尿标本，测定尿糖值 (测定方法同血糖测定). 所有血标本均经离心分离血清，-80℃冰箱保存至同批测定.统计学处理：试验结束后计算各受试者试验中血糖值均数(x)、标准差(s)及变异系数(CV)，计算试验中每10 min的平均葡萄糖输注率(glucose infusion rate， GIR)、机体总葡萄糖利用率 (钳夹开始 20~120 min内平均GIR) 和最大葡萄糖利用率 (钳夹稳态期最后30 min平均GIR). 全部数据均采用SPSS 13.0软件处理，计量资料以x±s表示，不同性别之间比较采用两独立样本t检验.2结果全部受试者均成功完成钳夹试验，检查结束后均未发生低血糖反应及其他异常反应，静脉穿刺部位未发生感染及静脉血栓形成. 结果显示高胰岛素正常葡萄糖钳夹技术成功建立.2.1外源性胰岛素�财咸烟谴�谢稳态形成基础血浆葡萄糖浓度为(4.26±0.39) mmol/L，在高胰岛素�舱�常葡萄糖钳夹过程中，血糖稳定在(4.99±0.15)mmol/L，稳态期血糖CV为(3.09±1.29)%. 基础血清胰岛素浓度为(3.81±2.20) mU/L，钳夹试验开始后血清胰岛素浓度迅速升高，于10 min时达到高峰 (133.70±21.91)mU/L，随后维持在(91.57±13.86)mU/L 至试验结束. 基础血清C肽浓度为(1.92±0.34)μg/L，整个钳夹过程中C肽浓度为(1.32±0.35)μg/L，各个时点的C肽浓度与基础状态相比呈逐渐下降趋势 (图1). 钳夹稳态期与基础状态相比较，升糖激素如血皮质醇、生长激素的浓度无明显上升，且均呈逐渐下降的趋势 (图2).2. 2高胰岛素�舱�常葡萄糖钳夹过程中的血糖及葡萄糖输注率变化钳夹试验过程中受试者血糖浓度稳定在(4.99±0.15)mmol/L，试验开始40 min内GIR上升较快，达到(9.45±3.17)mg/（kg·min），此后上升趋于平缓，在90~120 min时均保持在稳态 (图3). 钳夹开始20~120 min内GIR为(10.75±2.38)mg/（kg・min），稳态期GIR为(11.56±1.74)mg/（kg・min），不同性别之间GIR ［男(10.53±1.57)mg/（kg・min），女(12.25±1.59)mg/（kg・min）］差异无统计学意义（P=0.12）.3讨论1966年Andres依据糖代谢特点设计了高胰岛素�舱�常葡萄糖钳夹技术，1979年DeFronzo等［1］对该技术作了详细研究并应用于人体，从此推动了葡萄糖钳夹技术在世界范围内的应用，成为目前公认评价机体胰岛素敏感性的“金标准”. 本研究按照DeFronzo等［1］的方法进行设计，结果显示形成稳定高胰岛素状态，达到完全抑制肝脏内源性葡萄糖输出的目的；血糖钳夹在正常水平，变异系数小于5%；试验中内源性胰岛素分泌被抑制，升糖激素无明显释放，符合高胰岛素�舱�常葡萄糖钳夹技术成功建立的标准［1］. 正常人体内胰岛素浓度高于生理水平时肝糖输出可以被完全抑制，故钳夹试验中当达到高胰岛素稳态时外源性葡萄糖输注率 (GIR) 等于外周组织的葡萄糖利用率 (M值)，此时GIR可作为评价机体胰岛素敏感性的指标［1］. 贾伟平等［3］建立扩展高胰岛素��正常葡萄糖钳夹技术时稳态期胰岛素浓度为(63.00±4.86) mU/L时肝糖产生为0，故计算M值时可忽略肝糖的产生. 当对存在胰岛素抵抗的患者进行正常葡萄糖钳夹试验时，经典试验中采用的胰岛素输注率所达到的稳态期胰岛素浓度并不能完全抑制肝糖输出［4］.研究表明，无论是糖尿病患者还是其他胰岛素抵抗严重的患者，当采用较快的胰岛素输注率使稳态期胰岛素浓度达到200 mU/L以上时，肝糖输出几乎被完全抑制，可以避免肝糖输出影响试验结果［5- 6］. 本组10名受试者钳夹试验时均采用2 mU/（kg・min)的胰岛素输注率，稳态期胰岛素浓度与DeFronzo经典试验结果类似［1］. 不同实验室采用相同胰岛素输注率时稳态期胰岛素浓度相差较大，可能与试验具体操作、胰岛素测定方法及受试者空腹胰岛素浓度不同等因素有关. 钳夹稳态期胰岛素浓度不同，GIR值也不同，一般稳态期胰岛素浓度越高，GIR值越大［1， 3， 7-10］. 当对存在胰岛素抵抗的患者进行正常葡萄糖钳夹试验时，稳态期胰岛素浓度较高，评价胰岛素敏感性时可采用稳态期胰岛素浓度加以较正［11］.综上所述，高胰岛素�舱�常葡萄糖钳夹试验中达到胰岛素�财咸烟谴�谢稳态后的外源性葡萄糖输注率等于外周组织的葡萄糖利用率，葡萄糖输注率(GIR) 可作为评价机体胰岛素敏感性的指标. 近年来钳夹试验中微量精确输液泵和计算机技术的应用大大简化了试验操作难度并提高了成功率，高胰岛素正常葡萄糖钳夹技术将在糖尿病的预测、糖尿病发病机制研究等方面发挥重要作用.【参考文献】［1］ DeFronzo RA， Tobin JD， Andres R. 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高胰岛素—正常血糖钳夹技术的护理及改进分析作者：郑晓岩来源：《糖尿病新世界》2017年第05期DOI：10.16658/ki.1672-4062.2017.05.007[摘要] 目的分析研究高胰岛素-正常血糖钳夹技术的护理及改进。

方法随机选取该院2016年10月—2017年1月期间收治的60例代谢综合征（MS）患者，按照入院顺序，分为实验组与常规组，各30例。

所有患者，均行高胰岛素-正常血糖钳夹试验，其中，常规组，行常规护理，实验组，实施经改进的护理方式，对比分析护理效果。

结果对比不良反应，实验组发生率为3.3%，常规组为16.7%，实验组显著低于常规组（P[关键词] 高胰岛素；正常血糖钳夹试验；护理；改进[中图分类号] R473 [文献标识码] A [文章编号] 1672-4062（2017）03（a）-0007-02Analysis of Nursing and Improvement of Hyperinsulinism-Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp ZHENG Xiao-yanDepartment of Endocrinology， Jinan Central Hospital， Jinan， Shandong Province， 260013 China[Abstract] Objective To analyze the nursing and improvement of hyperinsulinism- hyperinsulinemic-euglycemic clamp. Methods 60 cases of patients with metabolism syndrome admitted and treated in our hospital from October 2016 to January 2017 were randomly selected and divided into two groups with 30 cases in each according to the admission order， and all patients were treated with hyperinsulinism-hyperinsulinemic-euglycemic clamp， and the routine group adopted the routine nursing， while the experimental group adopted the improved nursing method， and the nursing effect was compared and analyzed. Results The incidence rate of adverse reactions in the experimental group was obviously lower than that in the routine group（3.3% vs 16.7%）（P[Key words] Hyperinsulinism； Hyperinsulinemic-euglycemic clamp； Nursing； Improvement胰岛素抵抗（insulin resistance ，IR）是导致代谢综合征（Metabolic syndrome，MS）的重要病因，目前，就国外内而言，高胰岛素—正常血糖钳夹技术是评价IR公认的“金标准”[1]。

高胰岛素 -正葡萄糖钳夹技术失败原因分析及改进措施摘要:目的对高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术出现失败原因进行分析，以保证试验顺利完成。

方法对2017年12月至2019年10月本科共126例糖尿病及肥胖患者在进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹中所出现的失败例数进行分析总结，找出失败的原因，拟定对策。

结果 126例患者中出现钳夹试验失败的有23例，失败原因包括试验前未停用睡前长效胰岛素；空腹血糖过高；试验中仪器操作失误；结论试验前医护患三方要良好沟通，试验者对仪器的熟练掌握程度、对患者血糖波动的准确评估、输液通畅情况的严密观察以及试验者正确的采血技术，是保证试验成功的关键。

关键词高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术；胰岛素抵抗；糖尿病；高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术是目前国际上公认的最精确的测定胰岛β细胞功能的方法[1]，该技术主要针对存在胰岛素抵抗的人群[2-4]。

我科在2017年12月至2019年10月利用高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术对97例2型糖尿病患者及29例肥胖患者是否存在胰岛素抵抗的情况进行了检测。

其中有23例患者试验失败。

失败原因包括试验前未停用睡前长效胰岛素；空腹血糖过高；试验中仪器操作失误等。

针对失败原因进行分析，提出改进措施，现报道如下。

1临床资料1.1一般资料 97例2型糖尿病患者中男41例，女56例，年龄21-60岁，FBG：14.91-17.68mmol/L，均符合ADA糖尿病诊断标准。

29例肥胖患者中男11例，女18例，年龄15-47岁，BMI：29.86-35.12kg/m2，均符合WHO肥胖诊断标准。

1.2方法首先向患者介绍试验的目的和方法。

嘱患者试验前1天晚餐前停用各类胰岛素，8pm开始禁食8-12h。

试验当日分别于患者两侧前臂留置20 G和22 G静脉留置针。

试验开始10min后，每 5 min 测定患者血糖数值，每 30 min留取C 肽标本。

试验第120-150min患者血糖波动稳定在 5.0±10% mmol/L 左右，此时葡萄糖输注率处于稳定状态，以此评定机体对胰岛素的抵抗程度[2]。