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同种异体软骨移植免疫排斥反应的研究进展关节炎、颞颌关节疾病及关节机械损伤以及颌面部美容整形的发展，都使得软骨治疗成为倍受关注的对象，由于软骨组织中无血管、神经及淋巴等供应，而软骨细胞又为终末分化细胞，软骨缺损很难自身修复，故治疗以软骨移植为主。
软骨移植包括自体、同种异体、异种移植，其中自体软骨移植来源有限、给患者带来二次创伤并增加患者疼痛而致应用受限，异种移植由于强烈的免疫排斥等问题研究还处在基础实验阶段，而同种异体软骨移植来源广泛，生物学性能良好，可望成为较理想的软骨移植物，但其存在的免疫排斥反应影响移植物在体内的长期存活，是目前研究不容忽视的问题[1]。
1免疫原性来源1.1软骨细胞表面的主要组织相容性抗原（MHC）：软骨细胞同其他有核细胞一样表面也表达MHC I类分子[2]，供者和受者细胞间MHC分子不匹配所诱发的细胞和抗体介导的细胞毒反应是引起同种异体软骨移植免疫反应的关键[3]。
许多学者在人或猪的软骨组织实验研究中表明：软骨细胞只表达MHC I类分子，而不表达MHC II，但与γ-干扰素（IFN-γ）共培养诱导后可表达MHC II，进而发挥类似抗原提呈细胞的功能，促进免疫排斥反应[4-5]。
Romaniuk等[6]进行了兔同种异体骺软骨细胞移植研究，发现1周后移植物周围有大量MHC II+细胞、CD4+细胞及单核/巨噬细胞浸润，这可能也是由于MHC I类分子激发同种异体淋巴细胞活化，分泌IFN-γ进而诱导所致。
1.2软骨细胞特异性分化抗原（CSDA）：Langer等[7]通过分析白细胞游走试验发现，大鼠经同基因软骨细胞注射或软骨刨削后可发生自身反应，首次证实了软骨细胞特异分化抗原(CSDA)的存在。
Moskalewski 等[8]在同种异体软骨移植的大鼠模型研究中发现，间期接受2～3次大鼠软骨细胞移植的兔血清中含有高滴度的抗软骨细胞的细胞毒抗体，同时对新鲜或培养24h的软骨细胞溶胞产物Western blot蛋白分析中检测到了一种抗原，而在成纤维细胞及内皮细胞中未检测到，表明软骨细胞特异性抗原在移植免疫中发挥了重要作用。
胞外多糖(EPS extracellular polysaccharide)早在50年代人们就认为胞外多糖可能是青枯菌的致病因子，随后围绕青枯菌胞外多糖的病理学意义进行了大量研究。
H u sain和Kelman比较了青枯菌自发无毒突变株和野生型菌株的特点，发现自发无毒突变株不产生胞外多糖，致病力丧失，因此认为胞外多糖在致病过程中可能具有重要作用l 5l。
青枯菌的胞外多糖是由多种化学物质组成的复合物，其中主要的组成成分是氮乙酞半乳糖醛酰胺。
研究发现，不同青枯菌小种的胞外多糖的组分有所不同，同一小种也存在不同类型的胞外多糖。
一些研究显示，一个称为EPS I的胞外多糖，可能与Ralstonia solanacearum的致病性最为相关I6J EPS I合成的特异突变研究显示，即使直接注入大量的突变菌细胞进入植物茎组织，与非突变菌比较，其植株的萎蔫和死亡程度也很低。
通过土壤接种试验也显示，尽管突变菌在维管组织中繁殖，但植株的发病很轻。
近年来的研究发现，胞外多糖的合成受l6 kI1的eps操纵子调控，涉及l0个调控基因产物和3个不同的调控信号，这种严谨的调控也从另一个角度说明EPS I对病原菌本身的重要性以及在病原菌对植物的致病性中的重要作用『青枯假单胞菌(pseudomonassolanacearu‘)或称青枯菌引起许多重要经济作物如烟草、花生、番茄等植物的萎焉病。
主要通过土壤传染病害，它的寄主范围很广泛，有33科100多个种，危害茄科植物为最多“。
青枯菌毒力株能产生胞外多糖，用特殊固体培养基培养时形成两种菌落形态即易变的和固定的，前者产生胞外多糖有毒力，后者很少产生这种多糖。
为此，日本科学工作者研究了这种胞外多糖的组成以及它与致病性的关系。
发现这种多糖是一种混合物一主要由N一乙酸半乳糖胺(2一氨基2半乳糖)和少量鼠李糖、葡萄糖以及某些简单肤所组成。
事实上，这是同型一N一乙酞半乳糖胺葡聚糖的一个例证。
其化学性质还不清楚，但认为这种胞外多糖与毒力有关系‘，这是因为它阻滞寄主植物维管束组织，导致水分输导的困难。
摘要：本研究旨在通过体外培养软骨细胞，探讨软骨细胞的生长特性、增殖能力及其在生物医学领域的应用潜力。
通过一系列实验，我们对软骨细胞的体外培养条件、增殖状态、细胞形态及功能进行了深入研究。
以下为实验总结。
一、实验目的和要求：1. 建立软骨细胞体外培养体系，优化培养条件。
2. 观察软骨细胞的增殖状态、细胞形态变化及功能表达。
3. 探讨软骨细胞在生物医学领域的应用前景。
二、实验仪器设备：1. 培养箱2. 超净工作台3. 移液器4. 倒置显微镜5. CO2培养箱6. 电热恒温水浴锅7. 流式细胞仪8. 低温离心机9. 低温冰箱三、实验设计及调试：（一）实验内容：1. 软骨细胞分离与培养2. 软骨细胞增殖实验3. 软骨细胞形态观察4. 软骨细胞功能实验（二）实验电路：无（三）实验设计及调试步骤：1. 对实验内容和实验电路进行分析，理出完成实验的设计思路。
2. 列出程序设计所需的特殊标志位、堆栈sp、内部ram、工作寄存器等资源的分配列表，分配列表时注意考虑资源在程序执行过程可能会出现冲突的问题。
3. 画出程序设计流程图，包括主程序和各子程序流程图。
4. 根据上述内容写出实验程序。
5. 调试程序，使用模拟仿真器进行模拟实验，观察结果，修改程序，继续调试，直至实验成功。
（四）实验调试过程中所遇到的问题、解决问题的思路和方法：1. 问题：软骨细胞在培养过程中出现污染。
解决方法：加强无菌操作，提高实验室空气质量，定期更换培养箱内的空气。
2. 问题：软骨细胞增殖缓慢。
解决方法：优化培养条件，调整细胞密度，增加生长因子。
3. 问题：软骨细胞功能表达不足。
解决方法：延长培养时间，提高细胞浓度，优化培养条件。
四、实验结果与分析：1. 软骨细胞在体外培养条件下，成功分离并建立了稳定的细胞系。
2. 软骨细胞增殖实验结果显示，细胞在体外培养条件下具有较好的增殖能力。
3. 软骨细胞形态观察表明，细胞呈典型的软骨细胞形态，细胞质丰富，细胞核清晰。
高浓度甲状腺素对软骨细胞聚集体（pellets）体外形成软骨组织的作用作者：刘瑾春等来源：《中国美容医学》2012年第15期[摘要]目的：药物浓度（100nM）甲状腺素对组织工程软骨形成的作用。
方法：将软骨细胞聚集体分为常规培养组（DMED+10%FBS）和100nM甲状腺素组（DMED+10% FBS+100nM甲状腺素），体外培养1、2和3周取材进行大体形态、组织学、二型胶原和十型胶原免疫组化染色和软骨特异基因PCR分析。
结果：100nM甲状腺素组形成的软骨细胞聚集体的体积和湿重均明显低于常规培养组，甲苯胺兰、二型胶原（ColⅡ）染色较常规培养组弱，软骨细胞特异基因的表达水平与常规培养组相似，软骨细胞肥大相关基因十型胶原（ColⅩ）及基质金属蛋白酶13（MMP13）的表达较对照组减弱，成骨方向分化相关基因（ColⅠ，Runx2）的表达与常规培养组相似。
结论：高浓度甲状腺素能够抑制软骨细胞肥大，但同时也抑制了软骨细胞增殖和软骨细胞基质分泌。
[关键词]甲状腺素；软骨组织工程；软骨细胞；细胞外基质；细胞聚集体[中图分类号]Q813.1 [文献标识码] [文章编号]1008-6455（2012）08-1324-04软骨组织工程为软骨缺损修复提供了一种新的治疗方法[1]。
软骨细胞是软骨组织工程种子细胞的一个重要来源，目前应用软骨细胞为种子细胞在体内外已经能够成功构建出精确形状的成熟软骨组织[2-3]。
但是体外构建的组织工程软骨的生化和力学质量与生理软骨仍具有一定的差距[4]。
在目前软骨细胞常规培养方案（主要为DMEM添加10%胎牛血清）基础上寻找新的优化成分是软骨组织工程的课题之一。
1 材料和方法1.3 软骨细胞pellets培养：第二代软骨细胞（P2）聚集体（pellets）根据培养基的不同分为2组，常规组培养基：低糖DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素。
100nM甲状腺素组：低糖DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素，100nM甲状腺素。
天然生物支架在软骨修复中进展【关键词】软骨修复关节软骨缺乏再生能力，外伤或疾病引起的软骨缺损需利用软骨或其它材料修复。
自体软骨来源有限，且容易造成供区缺损，应用受到限制。
异体软骨曾广泛应用，但可引起免疫排斥反应，而导致细胞死亡及功能丧失。
骨膜移植曾风行一时，但其存有远期效果不稳定的缺陷，使得人们持续探索更完善的修复方法。
体外软骨细胞培养成功，引发人们尝试直接用软骨细胞修复软骨缺损。
1968年，Chertman等将软骨细胞悬液注射到关节软骨缺损部位，结果表明：缺损为滑膜成纤维组织修复，镜下仅见少量新生软骨细胞结节。
1977年，Green等以脱钙骨作为支架，并接种上软骨细胞，移植到缺损部位。
虽未成功，可喜的是作者第一次提出：如能找到一种合适的支架材料，将软骨细胞接种于其上，即有可能形成良好的软骨组织修复。
当前，在组织工程中开发为细胞培养支架的生物支架材料主要分为两类，即天然生物支架材料和人工合成的支架材料。
天然生物支架材料具有细胞信号识别，促进细胞的黏附、增殖和分化、良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点，显示出人工合成支架材料无可比拟的优势。
本文就天然生物支架材料在软骨修复中的现状和研究进展做如下综述。
1天然脱细胞生物支架材料天然脱细胞生物支架材料主要利用同种或异种器官／组织，经脱细胞、去除抗原处理得到脱细胞基质材料。
细胞外基质(ECM)是由细胞自身分泌组成的并围绕在细胞周围主要含有胶原蛋白、纤维蛋白粘连素、层粘连蛋白，层连素等。
细胞外基质不仅为细胞提供了一个支持结构和附着位点，而且对细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控有重要作用和显著影响。
目前已经有研究应用同种异体脱细胞材料修复膀胱、尿道、动脉和皮肤缺损［1～3］，以及构建心脏瓣膜［4］，结果比较满意。
另外关于脱细胞软骨基质和小肠粘膜下基质(SIS)这2种天然的细胞外基质材料应用也有相关的研究报道［5～7］。
脱细胞基质材料具有多种天然细胞外成分，有利于细胞的吸附，增殖和分化并具有一定的力学强度，可作为组织填充物而长期存有；并且具有较好的组织亲和性和相容性，可诱导软骨细胞向其中生长而重建软骨，在未来组织修复中它们将拥有广泛的应用前景；但其脱细胞后的孔穴大小及孔穴间的连接缝隙的大小制约着种植细胞向深层发展。
周期性张应变对正常和骨关节炎软骨细胞糖胺多糖分泌的
影响的开题报告
背景介绍：
周期性张应变是指在一定强度、频率和时间的作用下，使细胞受到周期性拉伸和压缩的力量，并通过这种方式影响细胞的生理函数。
在关节软骨中，周期性张应变通
常是由于关节运动引起的，其中包括正常关节运动和关节炎时的异常运动。
关节软骨
细胞是关节软骨的主要细胞，其分泌的糖胺多糖（GAGs）是维持关节软骨结构和功能的重要组成部分，与关节疾病有密切关系。
研究目的：
本研究旨在探讨周期性张应变对正常和骨关节炎软骨细胞GAGs分泌的影响，以便更好地理解关节软骨细胞的生理功能和疾病发生发展的机制。
研究方法：
本研究将正常和骨关节炎软骨细胞分别暴露在不同的周期性张应变刺激下，分别检测其GAGs分泌水平的变化。
周期性张应变刺激将通过设备施加，可以控制其强度、频率和时间。
GAGs的分泌水平将通过酶联免疫吸附法等方法进行测量。
研究预期结果：
本研究预期可以揭示周期性张应变对软骨细胞GAGs分泌的影响，进一步理解关节软骨细胞的生理功能和疾病发生发展的机制。
作者：许宏权，黄向莹，陈晓洁，王传家，纪影畅
【关键词】软骨细胞；体外培养；糖胺多糖
［摘要］目的：观察软骨细胞体外培养的情况及其合成糖胺多糖的特点。
方法：通过ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞，定量接种6×106个细胞于培养皿，加入培养基，每周传代一次，连续5周，留取所有培养液用阿利新蓝法（alcian blue）测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖（gag）的变化；利用倒置显微镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。
结果：软骨细胞在ｐｈ值为7.0，含10%胎牛血清的dmem培养液中生长良好，体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质，第二代传代细胞分泌gag的能力最强。
结论：软骨细胞体外培养生长良好，合成大量的糖胺多糖类基质。
传代第二代是最佳接种时间。
［关键词］软骨细胞；体外培养；糖胺多糖
pig articular chondrocytes in culture form glycosaminoglycan
1 材料和方法
1.1 动物与试剂实验动物:贵州香猪(购自上海市第九人民医院动物实验中心)，体重(5±0.5)kg，雌雄不限。
试剂:dmem培养液，胎牛血清，0.15%的ⅱ型胶原酶（美国sigma公司）、0.25%的胰蛋白酶。
1.2 实验分组软骨细胞每周传代一次，连续5周，共收集5组标本。
1.3 猪关节软骨细胞的提取在无菌操作下，切下满月小猪膝、髋关节软骨，仔细剥离皮肤和软骨膜，用眼科剪将软骨组织剪成2 mm~3 mm大小的方块，置于离心管中，氯霉素冲洗液冲洗3次，再以磷酸盐缓冲盐水（pbs）冲洗2遍后，加入两倍于软骨体积的0.15%ⅱ型胶原酶（sigma公司）在37 ℃恒温振荡器内消化。
1.4 收集细胞 3 h～4 h后第一次收集软骨细胞。
将上述悬浊液倒入150目不锈钢滤筛滤去软骨组织，用于隔夜消化，第二天早上收集。
过滤的液体2 000 ｒ/min离心8 min，轻轻吸除消化液，加入pbs液,漂洗1次,加入细胞培养液16 ml，振荡混和制作经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液。
锥虫蓝拒染实验观察细胞活力。
1.5 软骨细胞的培养将软骨细胞悬液密度调整至6×106/ml，以1 ml分别接种于塑料培养皿，加入6 ml培养液（dmem培养液加10%胎牛血清）。
置入37 ℃恒温培养箱(5%co2)培养［1］。
1.6 软骨细胞传代培养细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察80%汇合，即进行传代。
用血球记数板计数， dmem培养液稀释为6×106/ml，以3 ml分别接种到培养皿内，加入3 ml 培养液，37 ℃恒温培养箱(5%co2)内培养［2］。
1.7 倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况。
1.8 软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(gag)的定量检测阿利新蓝法（dms）测定培养液中gag含量。
定量接种6×106个细胞于培养皿，每周传代一次，留取所有培养液进行检测。
吸1 ml培养液，加入1.5%阿利新蓝溶液1.5 ml，室温放置10 min，480 nm比色，4硫酸软骨素作为标准溶液，绘制标准曲线。
根据标准曲线求得样本gag含量。
