组织匀浆器

ELISA组织样本的处理
1、采集组织：在冰冷的生理盐水中漂洗组织，除去血液，滤纸拭干，称重（100mg左右为
宜），剔除附属的结缔组织，称取组织块。

2、用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理盐水，组织：匀浆介质=1:10（或所用生理
盐水的体积总量为组织块重量的9倍），尽量保证样本间所取组织重量和加入匀浆介质（PBS或生理盐水）的比例一样。

然后用眼科小剪尽快剪碎组织块（操作要在冰水浴中进行）。

3、组织匀浆：
a) 玻璃匀浆器：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水
冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手上下抽动或转动研磨杆数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

b) 组织匀浆/破碎机：用组织破碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，
也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在
冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

4、将制备好的10％匀浆用离心机4℃，5000g离心5～10min，收集各匀浆样本上清。

5、BCA法测定各组织匀浆样本总蛋白量，便于后续统计分析数据。

6、将收集的上清分装成适量小份，按需保存备用：
4℃下，可保存不超过72小时；
-20℃下，可保存不超过1个月；
-80℃下，可保存不超过2～6个月；
7、根据实验需要，取适量上清液进行各种ELISA测定。

注意事项：
1、离心后的样本应清澈透明，无沉淀；
2、冻存的匀浆样本应避免反复冻融；
2、对于冷冻保存的样本，使用前在冰上融化，避免加热融化。

[机械法]细胞破碎的方法、原理和优缺点
1、高速组织捣碎机
捣碎机转速可达10,000r/min，具高速转动的锋利的刀片，宜用于动物内脏组织的
破碎。

操作：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至
最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

特点：由于旋转刀片的机械切力很大，制备一些较大分子如核酸则很少使用。

2、组织匀浆器
制作匀浆器的材料通常用玻璃，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。

操作：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。

特点：匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。

此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

但是，这种方法也较易造成堵塞；团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌以及某些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。

3、研钵
多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。

值得注意的是：在研磨过程中局部往往生热导致变性或pH值变化，尤其是研磨玻璃粉和氧化铝时；而且磨细剂的吸附也可导致损失。

4、细菌磨
是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口。

操作时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。

之袁州冬雪创作机械法主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常常使用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等.1. 组织捣碎机将资料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度.一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以上.由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用.2. 匀浆器先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆往返研磨，上下移动，即可将细胞研碎.匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙坚持在十分之几毫米间隔.制作匀浆器的资料，除玻璃外，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等.此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织. 存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理.3. 研钵多用于细菌或其他坚硬植物资料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果.4. 细菌磨是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口.操纵时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎.物理法主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法.在生化制备中常常使用的方法有：1. 反复冻溶法原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞表里溶剂浓度的突然改变而破坏细胞. 方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞布局破碎. 特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性资料，对微生物细胞作用较差.2. 急热骤冷法将资料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒资料.3. 超声波处理用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物资料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入下可以停止细胞破碎.其破碎机理：能够与空化现象引起的冲击波和剪切力有关.超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关. 特点：操纵简单，重复性较好，节俭时间；多用于微生物和组织细胞的破碎. 存在问题：超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操纵简便，液量损失少，但是超声波发生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活.而且大容量装置声能传递，散热均有坚苦，应采纳相应降温措施.对超声波敏感和核酸应慎用.空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会发生活性氧，所以要加一些巯基呵护剂.化学及生物化学法 1. 自溶法在一定PH和适当的温度下，操纵组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法.此过程需较长时间，常常使用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染.2. 酶溶法操纵各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来.有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解. 特点：a) 此法适用多种微生物；b) 具有作用条件温和；c) 内含物成分不容易受到破坏；d) 细胞壁损坏的程度可以节制. 存在的问题：易造成产品抑制作用，这能够是导致胞内物质释放率低的一个重要因素.而且溶酶价格高，限制了大规模操纵.若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操纵.别的酶溶法通用性差，分歧菌种需选择分歧的酶.有一定局限性，不适宜大量的蛋白质提取，给进一步纯化带来坚苦.3. 化学渗透法某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、概况活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来.其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的布局与组成. 特点：多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常常使用此法破碎细胞. 存在的问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产品也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞. 小结无论用哪种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目标物质的提取. 先容的几种细胞破碎的方法，可谓各有千秋，在实际应用中，应尽能够思索全面，选择最迷信、有效的方法.|||顺便提个问题：关于反复冻融有很多资料，但是都不敷详细，想请教做过这方面的酷友们：1、重悬缓冲液（裂解液？，PBS？）2、冻溶温度（液氮？，-20？，-80？）3、冻结温度（37？，40？）4、反复次数（3次以上？）反复冻融实际上最好与超声波破碎或酶解一起使用，否则冻融后黏度很大，蛋白质容易堆积，通常都是反复冻融后超声波处理，这样效果比较好<br />你问的几个问题其实都没有详细答案，缓冲液，温度等都与详细蛋白质，详细实验要求有关，次数是基本达到你的要求即可。

各种组织匀浆样本用于ELISA检测的处理方法大鼠肺组织匀浆制备过程：1.WB法：在组织匀浆器中加入大鼠肺和5体积的匀浆缓冲液进行匀浆，4摄氏度下3000转离心20分钟后，收集上清。

用Coomassie Plus Protein Assay 测定总蛋白浓度. 用等量的样本buffer与20微克样本混合(100 mM Tris-HCl, 2% SDS, 0.02%溴酚蓝,和10%甘油煮几分钟之后电泳.EILSA：肺用5体积的buffer进行匀浆，缓冲液由10 mM HEPES, 10 mM KCl, 0.5 M 蔗糖, 1 mM EGTA, 1 mM DTT构成。

匀浆组织在750 xg 下离心10 分钟分理出细胞核. 含有细胞质部分的上清液储存在–70摄氏度冰箱用于MIP-2蛋白质测定.2.BAL液收集后, 收集左肺做TNF-alpha, MIP-2, 和移行蛋白表达评估. 肺用1mL细胞裂解液在匀浆器中进行匀浆。

得到的组织匀浆在10000Xg下离心10分钟. 上清液储存在–80 摄氏度留用于后面的检测。

3.冻存的的组织样本称重加入匀浆缓冲液（4摄氏度，每100毫克组织中加入1毫升缓冲液），样本进行匀浆和一次冻融,超声10分钟后在4摄氏度孵化一个小时。

最终得到的组织匀浆在120,000 x g下离心. 组织上清液用于细胞因子测定，这些数据用每毫克组织表达。

4. 取三分之一冻存的来源于？在4摄氏度细胞裂解液中孵化1小时的肺进行匀浆，组织匀浆之后超声并在4摄氏度12,000 转下离心10 分钟 . ELISA 检测TNF-alpha, MIP-2, and IL-6 的组织匀浆的内容。

组织匀浆总蛋白采取Bradford法.大鼠脾和肺组织匀浆制备过程：TNF-alpha检测脾和肺组织匀浆过程：冰冻组织样本称重后匀浆（每100毫克组织1毫升缓冲液）。

匀浆后的组织进行一轮冻融后，超声10分钟在4摄氏度下孵化一小时。

组织匀浆方法
组织匀浆方法是一种常见的实验技术，它可以将组织样本破碎并均匀分散在缓冲液中，以便进行后续的实验操作。

下面将介绍一些常用的组织匀浆方法。

1. 切片法
这是一种最常见的组织匀浆方法。

首先将组织样本切成小块或薄片，然后用匀浆器或超声波仪器将其破碎。

这种方法适用于较硬的组织样本，如肌肉、骨骼等。

2. 挤压法
这种方法适用于较软的组织样本，如肝脏、脾脏等。

将组织样本放在筛网上，用匀浆器或手动挤压器将其挤压，使其破碎并均匀分散在缓冲液中。

3. 针刺法
这种方法适用于较小的组织样本，如小鼠肝脏、心脏等。

将组织样本放在离心管中，用针头将其刺破，然后用匀浆器或超声波仪器将其破碎。

4. 酶消化法
这种方法适用于含有细胞的组织样本，如肝脏、胰腺等。

将组织样
本用酶消化液消化，使细胞破裂并释放出细胞质，然后用匀浆器或超声波仪器将其破碎。

无论采用哪种方法，组织匀浆前都需要将匀浆器或超声波仪器消毒，并在操作过程中保持无菌。

此外，匀浆时间和速度也需要根据不同的组织样本进行调整，以避免过度破碎或不充分破碎的情况发生。

组织匀浆方法是一种重要的实验技术，它可以为后续的实验操作提供高质量的组织样本。

在实验操作中，我们需要根据不同的组织样本选择合适的匀浆方法，并注意消毒和无菌操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。

各类均质器一览——仅用于奥然公司培训1.研磨珠敲打式均质器（珠磨式均质器，珠磨式匀浆机），珠子高速敲打用途：动、植物组织（含甲壳类、单细胞藻类等）及的破碎细菌、真菌类微生物、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白质、细胞器甚至是小分子化合物的分离提取；主要品牌：法国Bertin，美国Biospec，美国MP bio，美国SPEX，瑞士Roche，德国Retsh，德国Qiagen2.研磨式均质器（匀浆机），研磨杵、研磨管高速摩擦用途：动、植物组织及细菌、真菌等的破碎、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白质的分离提取，小型研磨管/杵适合实验室微量生物样品，大型研磨管/杵适合工业类样品主要品牌：德国Schuett，宁波新芝，德国Retsh，日本Microtec3.探头式均质器（匀浆机），定子、转子高速旋转形成剪切力用途：动、植物组织以利于DNA/RNA、蛋白质的分离提取；大型设备可以用户工业样品的乳剂、霜剂制备主要品牌：美国Biospec，美国Talboys，德国IKA（广州产），瑞士Kinematica 4.超声波均质器（超声波破碎），气穴原理用途：细菌、真菌、单细胞藻类的破碎、裂解，以利于DNA/RNA、蛋白质的分离提取。

工业上用户样品的破碎、乳化、混匀等主要品牌：美国Misonix，美国Sonics，美国Branson(中国产)5.刀片式均质器（刀片式匀浆机），刀片高速切割用途：样品的进行细碎、匀化、分散、强烈搅拌、溶解有机物等主要品牌：美国Talboys，美国Waring，德国IKA，瑞士Consul，诸多国产品6.拍打式均质器（拍打式匀浆机），样品在无菌袋中被慢速敲打用途：活细菌、寄生虫/卵的提取，及活组织细胞的分离培养。

多用于食品（水果、蔬菜、肉类）的检验检疫，以及土壤、环境行业的研究。

主要品牌：法国Interscience，英国Seward，天津恒奥7.高压均质器（高压匀浆机），高压促使细胞破碎用途：细菌、真菌等的破碎、裂解。

实验室设备技术参数一览表一、实验室常用设备离心机（4台）（一）参考技术参数：小型台式冷冻离心机数量：1台神外1.最高转速 : 21,100 x g / 14,800rpm2.时间设定 : 1 min – 99 min; 1 min 增加.3.配置：主机+ 24 x 1.5/2.2ml角转子+ 0.5ml、0.2ml PCR管适配器各1套4.以上要求原装进口5.冷冻（二）参考技术参数：小型高速离心机数量：1台糖尿病1.最高转速：14500rpm,2.最大相对离心力：14000Xg,3.rpm/rcf转换显示：有4.功率：85W，5.加速至最高转速时间：13秒，6.从最高转速减速的时间：12秒，7.计时器最长设置时间：99分钟（连续离心），8.最大容量：1.2X1.5ml/2ml离心管，9.尺寸（厘米）：22.5X24X12，10.重量（包括转子）：4.3kg11.参考型号：MiniSpin plus (Eppendorf公司)（三）参考技术参数：台式离心机数量：1台风湿1.要求配置：最高转速4000r/min 最大相对离心力2810xg2.三种离心管配套架各2个：3.①标准通用尖底50 ml离心管（直径3 cm，长度11.3 cm）4.②标准通用尖底15 ml离心管（直径1.8 cm，长度11.5 cm）5.③标准通用圆底5 ml 流式管（直径1.3 cm，长度7.2 cm）6.水平转子32×15ml、管架48×7ml7.三种离心管配套架各2个8.50ml离心管（直径3cm,长度11.3cm）9.15ml离心管（直径1.8cm,长度11.5cm）10.5ml离心管（直径1.3cm,长度7.2cm）参考型号：湘仪TDZ5-WS（四）参考技术参数：微型离心机数量：1台风湿要求配置：1）6000rpm/2000g快速离心；2) 标配两种转子：6×1.5/0.5/0.2ml离心管2×0.2ml 8联PCR排管3) 关盖启动4) 开盖即停参考型号：北京百晶BG-Qspin™参考型号仅供参考的参数纯水装置（1套）（一）参考技术参数：超纯水系统数量：1套糖尿病1.电源：220V/50Hz; 50-60W.2.进水水源：一般城市自来水,3.进水水压:0.15-0.4MPa，水温5-40℃。

一、实验目的1. 掌握核酸提取的基本原理和方法。

2. 学习使用不同试剂和设备提取动物组织中的DNA和RNA。

3. 了解核酸鉴定和定量分析的方法。

二、实验原理核酸是生物体中携带遗传信息的分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。

DNA主要存在于细胞核中，而RNA主要存在于细胞质中。

本实验通过提取动物组织中的DNA和RNA，并进行鉴定和定量分析，以了解核酸在生物体中的作用。

三、实验材料与仪器材料：1. 新鲜动物组织（如鸡肝、鸡血等）2. 10% SDS（十二烷基硫酸钠）3. 1M Tris-HCl（pH 8.0）4. 0.5M EDTA（pH 8.0）5. 95% 乙醇6. 70% 乙醇7. 氯仿8. 异丙醇9. 1.5M NaCl10. 淀粉酶11. 蛋白酶K12. 磷标准溶液13. 钼酸铵试剂仪器：1. 组织匀浆器2. 离心机3. 水浴锅4. 分光光度计5. 电子天平6. 移液器四、实验步骤1. 组织匀浆：将新鲜动物组织放入匀浆器中，加入适量缓冲液（1M Tris-HCl，pH 8.0）和蛋白酶K，进行匀浆处理。

2. 蛋白质变性：向匀浆中加入10% SDS，使蛋白质变性。

3. 离心分离：将匀浆液在4℃、12000 rpm下离心15分钟，分离出上清液和沉淀物。

4. DNA提取：将上清液加入氯仿和异丙醇，充分混匀，静置5分钟，离心分离，收集沉淀物。

5. RNA提取：将沉淀物用1.5M NaCl溶液溶解，加入淀粉酶和蛋白酶K，进行消化处理，加入95% 乙醇和70% 乙醇，静置沉淀，离心分离，收集沉淀物。

6. 核酸鉴定：将DNA和RNA沉淀物加入适量缓冲液，用紫外分光光度计测定其吸光度，判断核酸含量。

7. 核酸定量：使用定磷法测定DNA和RNA的磷含量，计算其浓度。

五、实验结果与分析1. 核酸鉴定：通过紫外分光光度计测定，DNA和RNA的吸光度分别为280 nm和260 nm。

2. 核酸定量：定磷法测定结果显示，DNA和RNA的磷含量分别为5.6 μg/ml和2.8 μg/ml，计算其浓度分别为1.6 μg/ml和0.8 μg/ml。

而是将需要匀浆的脑组织取出后，用冰的生理盐水清洗去血块，再用滤纸吸干水分，称重记录。

放入匀浆器口，用冰过的小剪刀稍剪碎，因为这样匀浆会更快一些。

按你需要的配比（我们用1：10）分2-3次加入冰的生理盐水匀浆。

做完一批后迅速去离心，然后取上清液，冷冻保存。

具体的步骤:
1、麻醉：腹腔注射复合麻醉剂，0.2ml/100g；
2、消毒：碘酒酒精消毒，碘酒两遍，酒精一遍；
3、快速断头：注意要用锋利的剪刀。

4、迅速剪开头皮，暴露颅骨，用消毒的咬骨钳迅速掀去颅骨，暴露大脑，用剪刀剪取脑时有几个步骤需要注意：
1---鼠脑不大因此很难把持，可以上来就先断头，然后左手用一止血钳夹住断端骨2---右手持剪，从鼠头背面颈根部一直剪到近鼻尖处，在这些地方不用太讲究，开3---用剪刀从颈根部骨面剪开个小口，就着这个口，用蚊氏钳把一些外周的的组织4---然后把钳子的一只脚伸到剪开的一侧颅骨骨面下，夹的面积尽量大一些，然后5---把鼠头调转过来，这时露出最头侧的神经，将其剪断，按照上面站友介绍的办那我来告诉你方法：
1，已醚麻醉；
2，断头；
3，沿双眼剪开；
4，双眼中点向后剪开至延髓平面，形成T字开口；
5，换成咬骨钳，延T字开口将颅骨翻向两侧，
6，标本浸入冰水（脑脊液）中，以称药勺刮断连接的脑神经，整脑既完成。

熟练者从2-6约需要10秒。

微生物实验室匀浆器操作规程1 玻璃组织匀浆器品名匀浆器2 规格2ml 5ml 10ml3玻璃匀浆器材质高硼硅玻璃95料4用途玻璃匀浆器的作用：让玻璃管与柱塞之间微小的缝隙和细微的凹凸咬合,将其柱塞转动时,产生碾切作用,使生物细胞和其他较硬的细胞组织被轻易的碾特点：采用优质玻璃原料，纯手工精密烧制而成.5 玻璃组织匀浆器使用方法5.1 冲洗,高压灭菌备用。

5.2选择合适的匀浆缓冲液,左手持玻璃管中部，右手持柱塞顶部，用力研磨。

5.3 在冰上匀浆,匀的次数依实验样品和目的而定5.4 匀浆完毕,倒出样品。

5.5 冲洗，高压灭菌备用。

6 注意事项6.1打开匀浆器以前，匀浆器停止工作至少一分钟以使气溶胶沉淀。

6.2在感染组织或材料用任何开放的装置研成粉的工作最好在生物安全柜内操作。

6.3玻璃研磨器易碎，不适合用于传染性物质的操作。

7目的正确及时地处理临床标本，防止错漏事故的发生。

8标本种类1.血液及骨髓标本分离操作规程2.导管标本分离操作规程3.脑脊液标本分离操作规程4.胸腹水标本分离操作规程5.胆汁标本分离操作规程6.心包炎标本分离操作规程7关节炎标本分离操作规程8.鞘膜积液标本分离操作规程9.下呼吸道标本分离操作规程10.上呼吸道标本分离操作规程11.尿标本分离操作规程12.粪便标本分离操作规程13.伤口分泌物标本分离操作规程14.女性生殖系统标本分离操作规程15.男性生殖系统标本分离操作规程16.组织标本分离操作规程17.真菌培养标本分离操作规程以上操作规程请参考SOP。