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fish技术定量的方法一、引言随着生物科学技术的不断发展，荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，简称FISH）技术在生物学研究领域得到了广泛应用。
作为一种非放射性杂交技术，FISH在基因表达、染色体核型分析、基因定位等方面具有显著优势。
本文旨在介绍FISH技术定量的方法，以期为相关领域的研究者提供参考。
二、FISH技术简介1.原理FISH技术利用荧光标记的核酸探针与目标DNA序列特异性结合，通过荧光显微镜观察杂交信号，实现对特定基因或染色体区域的定位与分析。
2.操作步骤FISH技术的操作步骤主要包括：探针设计、样本处理、染色、图像获取与分析、数据处理与定量分析。
3.优点与局限性FISH技术具有非放射性、高灵敏度、特异性强、操作简便等优点。
但同时也存在一定的局限性，如对探针设计的要求较高、样本制备过程较为繁琐等。
三、FISH技术定量方法1.荧光染料选择选择具有良好光谱分辨率和量子产率的荧光染料，如FITC、Cy3、Cy5等，用于标记核酸探针。
2.样本处理与染色针对不同类型的样本（如细胞、组织切片、染色体悬液等），采用适当的处理方法进行制备。
染色过程中，需注意控制探针浓度、杂交温度、杂交时间等条件，以获得最佳实验效果。
3.图像获取与分析利用荧光显微镜对染色后的样本进行观察，捕获杂交信号。
通过专业图像分析软件，对图像进行处理和定量分析。
4.数据处理与定量分析对处理后的图像进行阈值设定、背景扣除等操作，计算目标区域的荧光信号强度。
根据信号强度，对基因表达水平、染色体拷贝数等进行定量分析。
四、实验应用与案例分析1.基因表达分析FISH技术可用于检测特定基因在细胞或组织中的表达水平，有助于研究基因在生物过程中的功能。
2.染色体核型分析FISH技术可实现对染色体核型的快速准确分析，对遗传病的诊断和染色体异常研究具有重要意义。
3.细胞定位分析通过FISH技术，可定位特定基因在细胞内的表达位置，有助于研究细胞结构和功能。
FISH简介荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, 简称FISH)由于其直观, 快速, 敏感性⾼和⽅便灵活越来越得到⼴泛应⽤, 尤其是在⾎液学领域中. 因为⽩⾎病标本⽐较容易取得和制备, 不同类型的⽩⾎病⼜往往有其特异的染⾊体异常, FISH在⽩⾎病诊断, 治疗监测, 预后估计和微⼩残留病检测等诸⽅⾯都正成为不可缺少的重要⼿段.FISH的基本原理很简单, 就是标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的DNA(玻⽚上的标本)退⽕杂交, 通过观察荧光信号在染⾊体上的位置来反映相应基因的情况. FISH探针按标记⽅法可分为直接标记和间接标记: ⽤⽣物素(biotin)或地⾼⾟(digoxingenin)标记称为间接标记, 杂交后需要通过免疫荧光抗体检测⽅能看到荧光信号, 因⽽步骤较多, 操作⿇烦, 其优点是在信号较弱或较⼩时可经抗原抗体反应扩⼤; 直接⽤荧光素标记DNA的⽅法称为直接标记. 由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号, 省去了烦琐的免疫荧光反应, 不再需要购买荧光抗体, 也由于近年来荧光互的亮度和抗淬灭性的不断改进和提⾼, 直接标记的荧光探针越来越成为⾸选, 采⽤多种不同颜⾊的荧光, ⽅便在同⼀标本上同时检测多钟异常. 其荧光强度和信号⼤⼩都易于在普通荧光显微镜下观察, 操作过程中也不需要严格避光, 使FISH过程变得简便⽽易于操作. FISH并不能取代传统的⽩⾎病MCI诊断, 但它却能使MIC分型更为准确和深⼊. , MIC即细胞形态学(M), 免疫学和细胞遗传学(C), 三者结合对⽩⾎病进⾏分型诊断, 对不同类型的⽩⾎病采⽤不同治疗⽅案⼿段. 随着⼈们对⽩⾎病的不断认识, 仅进⾏MIC分型不够全⾯, 还要加上对⽩⾎病的分⼦(M)诊断, 成为MICM分型. FISH就是连接细胞遗传学和分⼦⽣物学的桥梁.FISH流程仪器设备1、医⽤微波炉；2、⽔浴锅；3、OLYMPUS BX51荧光显微镜；4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。
FISH检测在临床上的应用FISH检测在临床上的应用一、简介- FISH（Fluorescence in situ hybridization）即原位荧光杂交技术，是一种用于研究基因组和染色体结构的分子生物学技术。
- FISH检测在临床应用中可以提供重要的染色体遗传学信息，用于诊断和监测某些疾病。
二、FISH检测的原理- FISH技术基于荧光标记的核酸探针与细胞或组织标本中的特定DNA序列发生互补杂交，通过荧光显微镜观察以检测特定基因组或染色体的异常。
- FISH检测可以提供高度准确的定量和定位信息，特别适用于检测具有微小或亚显性突变的染色体异常。
三、临床应用领域1、适用于癌症诊断和分型- FISH检测可以检测染色体上的特定基因重排，从而辅助癌症的诊断、分型和治疗方案的选择。
- 例如，FISH检测可以用于检测BCR-ABL融合基因以确认慢性髓性白血病的诊断。
2、适用于先天性遗传病的筛选和诊断- FISH检测可用于检测染色体异常，如唐氏综合征（21三体综合征）、爱德华氏综合征（18三体综合征）和智商障碍相关的染色体异常，用于婴儿和先天性遗传病的筛选和诊断。
3、适用于遗传性肿瘤相关基因的检测- FISH检测可以用于检测和定位遗传性肿瘤相关基因的异常，如BRCA1和BRCA2基因异常与乳腺癌和卵巢癌的遗传风险相关。
4、适用于感染性疾病的诊断和追踪- FISH检测可以用于检测和定位细菌、和寄生虫等感染性病原体的核酸序列，辅助感染性疾病的诊断和追踪。
四、技术要点和注意事项1、样本处理- 对于固定的细胞或组织标本，需要进行脱脂、脱水等预处理步骤。
- 不同类型的标本可能需要不同的处理方法，如骨髓涂片、组织切片等。
- 样本处理过程中需注意保持核酸完整性和避免污染。
2、探针设计与标记- 根据要检测的目标基因或染色体序列设计特异性的核酸探针。
- 核酸探针需要选择适当的荧光染料进行标记，以便在荧光显微镜中观察到。
- 标记的探针需要存储在适当的条件下，以保持标记稳定性和活性。
2 FISH REFERENCE2.1 Introduction and Overview简介和概述This section contains a detailed reference to the FISH language. Following the introduction, Section2.2 describes the rules of the language and how variables and functions are used. Section 2.3explains FISH statements and Section 2.4 describes how the FISH language links with PFC2D. Pre-defined FISH variables, functions and arrays are described in Section 2.5.这部分包含FISH语言的详细参考。
接下来，2.2描述语言规则及如何运用变量和函数。
2.3解释FISH 陈述。
2.4描述FISH语言如何与PFC联系在一起。
2.5讲述如何预定义FISH变量、函数和数列。
FISH is a programming language embedded within PFC2D that enables the user to define new variables and functions. These functions may be used to extend PFC2D’s usefulness or add use r defined features. For example, new variables may be plotted or printed, special particle generators may be implemented, servo-control may be applied to a numerical test, unusual distributions of properties may be specified, and parameter studies may be automated.FISH是PFC内置的一种编程语言，用户可以自定义变量和函数。
荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, 简称FISH)由于其直观, 快速, 敏感性高和方便灵活越来越得到广泛应用, 尤其是在血液学领域中. 因为白血病标本比较容易取得和制备, 不同类型的白血病又往往有其特异的染色体异常, FISH在白血病诊断, 治疗监测, 预后估计和微小残留病检测等诸方面都正成为不可缺少的重要手段.FISH的基本原理很简单, 就是标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的DNA(玻片上的标本)退火杂交, 通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况.FISH探针按标记方法可分为直接标记和间接标记: 用生物素(biotin)或地高辛(digoxingenin)标记称为间接标记, 杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号, 因而步骤较多, 操作麻烦, 其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大; 直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记. 由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号, 省去了烦琐的免疫荧光反应, 不再需要购买荧光抗体, 也由于近年来荧光互的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的荧光探针越来越成为首选, 采用多种不同颜色的荧光, 方便在同一标本上同时检测多钟异常. 其荧光强度和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察, 操作过程中也不需要严格避光, 使FISH过程变得简便而易于操作. FISH并不能取代传统的白血病MCI诊断, 但它却能使MIC分型更为准确和深入. , MIC即细胞形态学(M), 免疫学和细胞遗传学(C), 三者结合对白血病进行分型诊断, 对不同类型的白血病采用不同治疗方案手段. 随着人们对白血病的不断认识, 仅进行MIC分型不够全面, 还要加上对白血病的分子(M)诊断, 成为MICM分型. FISH就是连接细胞遗传学和分子生物学的桥梁.FISH流程仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OLYMPUS BX51荧光显微镜；4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
实验步骤1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。
4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测：9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。
把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。
1×PBS室温下洗3次，每次2min。
扩增：12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。
1×PBS室温下洗3次，每次2min；15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。
切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
最近有一些战友对荧光原位杂交技术比较感兴趣，我整理了相关资料和自己的心得，和大家交流一下。
不妥之处，请大家指出，共同讨论学习。
内容发布在丁香园和螺旋网上，有兴趣的战友也可以去那里看一下（/html/keshi/gaogan1/zhuanjiazaixian/20070515/1481.html）内容分三部分：一、概述1、克隆性染色体异常是肿瘤的特征2、染色体异常常见的类型3、染色体异常的检测方法二、荧光原位杂交及其探针1、荧光原位杂交的原理2、荧光原位杂交的探针三、荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交（按试验流程介绍）一、概述1、克隆性染色体异常是肿瘤的特征1914年德国遗传学家Boveri就提出染色体畸变与肿瘤起源相关，然而这还仅仅只是一个假说；1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）的患者中发现后来被称为费城染色体（Philadelphia chromosome）的微小染色体；1973年Rowley证实了Ph染色体是9号和22号染色体易位所致，这是人们在肿瘤中认识到的第一个染色体易位；目前，已经有11,500篇文献报道了55,600多种克隆性细胞遗传学异常。
这些染色体畸变，尤其是染色体易位及其相应的融合基因在肿瘤致病的起始阶段有着重要的作用，无不说明克隆性细胞遗传学异常是肿瘤的特征，在肿瘤起源中起重要作用。
2、染色体异常的常见类型染色体异常指数目异常和结构异常两类：前者包括整条染色体数目的扩增和缺失；后者包括染色体易位、插入、倒置、区带的缺失或扩增等。
下图是染色体数目异常染色体结构异常3、染色体异常的检测方法染色体异常的识别得益于二十世纪六十年代后发展起来的胰蛋白酶－姬姆萨染色和常规显带技术，使得常规筛查全基因组染色体异常和检测染色体核型改变成为可能。
染色体显带是细胞遗传学分析技术中标准和常用的方法，但耗时且依赖于获得良好的分裂相，还难于分析复杂和隐匿的异常。
PCR或荧光原位杂交（FISH，fluorescent in situ hybridization）对染色体异常的检出依赖于引物或探针与模板的结合，因此较常规显带具有更高的特异性，是高通量检测染色体异常的敏感和特异的方法。
二、荧光原位杂交及其探针1、荧光原位杂交的原理染色体荧光原位杂交始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，这种结合开创了一门新的学科——分子细胞遗传学。
其基础是Southern blot原理，以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记的亲和素或抗地高辛抗体将半抗原显示出来，通过荧光显微镜观察杂交信号。
FISH具有快速灵敏、特异性好的特点，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量；可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。
2、荧光原位杂交探针的类型FISH技术种类甚多，发展迅速，其实现需要获得能与靶序列互补结合的探针。
常用的探针有以下三类：1、染色体重复序列探针，主要是指着丝粒α-卫星DNA重复序列探针和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异常，同时由于G显带时，端粒区是苍白的，因此涉及此区的易位常难以检测，而应用端粒探针则弥补了G显带的不足；2、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针，用以检测染色体数目或结构异常；3、染色体单一序列探针，包括各类人工染色体探针，如酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）、P1人工染色体（P1 artificial chromosome, PAC）探针，主要用以识别染色体的易位、缺失和扩增。
α-卫星DNA（alpha satellite DNA）是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着丝粒DNA （centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的单体为单位组成的高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达100kb的着丝粒DNA区域，其杂交将产生很强的杂交信号。
因此常被选为着丝粒探针的来源。
The Wellcome Trust Sanger Institute（Hinxton, Cambridge）由Wellcome Trust和British Medical Research Council联合建立，是世界上较早开展人类基因组大规模测序并具有相当实力的测序中心。
该中心利用能容纳大片段人类基因组DNA的高容量载体（如粘粒、BAC、PAC等）构建了大片段人类基因组DNA文库，通过文库中末端相互重叠的DNA片段连接成叠连群（contig）并与鸟枪法相结合，加快了基因组测序，实现了人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）中人类基因组的物理作图（physical mapping）和基因组测序相结合的目标。
因此，这些克隆文库为基因定位研究提供了丰富的DNA 序列资源，NCBI Clone Registry（/genome/clone/）、Ensembl Genome Browser（/index.html）和UCSC Genome Bioinformatics（/）提供的网络生物信息学资源也记载了许多克隆基因组定位的详细信息，为我们选择相应克隆为作为染色体单一序列和端粒探针的来源提供了便利。
