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3基金项目广西壮族自治区卫生厅科研基金项目(N 1Z )广西医科大学生物化学与分子生物学教研室 南宁 53收稿日期252p53基因与52FU 联合作用诱导鼻咽癌细胞凋亡的研究3翁国庆 赖祥进1 黄文君1 陈凤坤 彭 娟(广西钦州市第一人民医院耳鼻咽喉科 钦州 535000)摘要 目的:研究通过转染野生型p53基因,并联合52FU 诱导人鼻咽癌CN E2细胞的凋亡作用。
方法:将克隆有野生型p53基因的pU HD10232p53质粒,用脂质体(Lipofectamine)介导的方法转染人鼻咽癌CN E2细胞,同时在培养液中加入52FU ;以R T 2PCR 检测p53基因的表达,通过AO/E B 染色和流式细胞术等方法进行细胞凋亡分析。
结果:经转染wt 2p53基因后,基因在细胞中的表达增加。
在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞增多。
流式细胞仪检测结果示,经转染质粒pU HD10232p53后,细胞的凋亡率为3512%,单纯用52FU 组的细胞凋亡率为3318%,而联合作用组的细胞凋亡率可达5319%。
结论:野生型p53基因与52FU 均可诱导人鼻咽癌细胞CN E2发生凋亡,野生型p53基因与52FU 联合作用,促进鼻咽癌细胞凋亡。
关键词 p53基因;鼻咽癌;52FU ;凋亡中图分类号:R73916 文献标志码:A 文章编号:10052930X (2008)022******* 鼻咽癌是我国常见恶性肿瘤,目前放疗和化疗是其主要治疗方法,但对于中晚期患者单一治疗是不够的,探索包括生物治疗在内的鼻咽癌综合治疗手段日益受到重视。
采用脂质体介导的野生型p53基因与52FU 联合作用,通过体外实验,探讨其诱导鼻咽癌细胞凋亡情况。
1 材料与方法111 材料11111 细胞株及培养条件:人鼻咽癌细胞株CN E 2由广西医科大学肿瘤研究所提供。
用含抗生素及10%新生牛血清的RPM I1640完全培养液在37℃、5%CO 2培养箱培养,至对数生长期用于实验。
P53基因功能及前沿研究现状一．P53基因的功能p53 基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因之一,是当前肿瘤分子生物学研究的热点。
自1979年Lane等[1] 发现p53 基因以来,人们对它的认识经历肿瘤抗原、癌基因、抑癌基因三个阶段。
近年的深入研究表明p53作为一种抑癌基因发挥着越来越重要的作用。
人类50％以上p53都发生了突变，导致了肿瘤的发生。
[2]P53基因定位于染色体17p13.1,长20kb,含有11个外显子，编码393个氨基酸组成的相对分子量为53*103的蛋白质。
P53蛋白是一个转录因子，参与细胞周期调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等。
主要执行DNA 损伤“检查点”功能，若DNA受损，p53蛋白水平迅速升高并激活其下游的p21/WAF1/CIP1基因表达，这是一组周期素依赖蛋白激酶的抑制剂，使细胞停滞于G1期，执行DNA修复。
若修复失败，p53则通过激活BAX基因通路诱导凋亡。
约50%的人类肿瘤与p53基因的等位失活或突变有关。
突变型P53则具有癌基因的作用，促进细胞恶性转化。
P53基因的突变常发生在结肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤。
P53基因功能失活机制有以下几种：1、P53基因自身突变，导致P53蛋白丧失与DNA结合的能力，这是P53基因失活的重要机制。
2、MDM2癌基因的负调节。
MDM2是P53蛋白的靶基因，P53蛋白刺激MDM2基因的表达，而MDM2蛋白可与P53蛋白结合，一直P53蛋白接到的反式激活、增殖抑制和诱导凋亡的功能，同时MDM2蛋白可以催化p53蛋白的降解，从而形成一个反馈调节环，负调节p53蛋白的活性。
3、p53蛋白与癌蛋白之间的相互作用可能是其失活的另一个重要原因。
DNA肿瘤病毒蛋白如SV40大T抗原、腺病毒E1B转化蛋白，人乳头瘤病毒E6蛋白等，均可以和P53蛋白结合，抑制其功能活性并促进其降解。
由于p53基因在肿瘤发生、发展以及诊断治疗中的重要作用，目前科学家正致力于寻找和发现其相关基因以及应用于基因治疗的有效方法。
局部晚期鼻咽癌新辅助化疗进展鼻咽癌是一种恶性肿瘤，生长在鼻咽部位，远离口腔和喉咙。
鼻咽癌常见于亚洲国家，如中国和东南亚地区。
据统计，中国每年新发鼻咽癌病例近2万例，其中约60%为晚期病例。
鼻咽癌的早期症状常被忽视，而晚期病例往往预后不佳，传统的放化疗治疗方案效果并不理想。
新辅助化疗是指在手术治疗前先进行化疗，可以减轻肿瘤的负担，缩小肿瘤体积，增加手术成功率。
然而，对于局部晚期鼻咽癌患者，传统的化疗方案效果不佳，常常出现药物耐药的情况。
因此，针对这一患者群体，新辅助化疗的研究成为科学界的热点。
近年来，随着生物技术的不断发展和临床研究的不断深入，新辅助化疗在局部晚期鼻咽癌治疗中得到了越来越多的应用。
以下是一些新近的研究进展：1. 靶向药物靶向药物是指通过特异性干预肿瘤细胞的特定分子，抑制其生长和转移的药物。
随着对鼻咽癌发病机制的深入认识，人们发现一些调节信号通路的基因和蛋白质在鼻咽癌中异常表达，并与肿瘤的发生和发展密切相关。
因此，研究者通过干扰这些靶标，进而抑制肿瘤细胞的生长和扩散。
例如，近年来已有研究显示，靶向抗血管生成的药物白蛋白紫杉醇（nab-Paclitaxel）与顺铂在鼻咽癌的新辅助化疗中应用可获得显著的疗效，增加手术的切除率，同时也降低了患者的不良反应。
2. 基因治疗基因治疗是指通过改变患者体内的基因表达，影响肿瘤细胞生长和扩散的治疗方法。
在局部晚期鼻咽癌的新辅助化疗中，研究者尝试利用基因治疗来加强化疗的效果。
近年来，有学者通过注射载有p53质粒的RNA干扰质粒输送系统，成功将p53基因导入局部晚期鼻咽癌患者的肿瘤细胞中，并同时与放化疗配合，取得了较好的治疗效果。
3. 免疫治疗免疫治疗是指利用人体自身的免疫系统来攻击肿瘤。
针对局部晚期鼻咽癌新辅助化疗，研究者尝试利用免疫治疗来增强治疗效果。
免疫治疗可分为两大类，一类是通过激活免疫细胞，增强其攻击肿瘤能力；另一类是以抗原特异性为基础，通过抗原识别机制识别并靶向杀灭肿瘤细胞。
Western印迹杂交分析p53蛋白在人鼻咽癌中的表达郑美莲 区宝祥 龙江斌 邓满泉 陈丽珍 梁启万 李辉梅(中山医科大学肿瘤防治中心;广州,510060)摘 要 目的:探讨p53蛋白在人鼻咽癌中的表达及其临床意义。
方法:采用Western印迹法结合免疫沉淀技术,检测鼻咽活检组织p53蛋白表达。
结果:104例鼻咽癌活检组织中,12例(11 5%)p53蛋白突变;8例鼻咽慢性炎症活检组织中,p53蛋白表达未见异常。
鼻咽癌病人中IgA/VC A抗体滴度 1 160者p53蛋白突变检出率11 8%(11/93),IgA/VCA抗体滴度 1 80者,p53蛋白突变检出率9 1%(1/11)。
IgA/EA抗体滴度阳性者,p53蛋白突变检出率14 1%(11/78),IgA/EA抗体滴度阴性者,p53蛋白突变检出率3 8%(1/26)。
p53蛋白表达异常的鼻咽癌病人中,有2例复发。
结论:鼻咽癌p53蛋白的异常表达多见于恶性程度较高,分期较晚,IgA/VC A滴度高和IgA/EA阳性的病例,提示p53基因在鼻咽癌中可能发挥一定的作用。
主题词 鼻咽肿瘤;基因,p53;印迹法,蛋白质中图号 R739.63Western Blot Analysis of p53Protein Expression in HumanNasopharyngeal CarcinomaZheng Meilian Ou Baoxiang Long Jianbin Deng Manquan Chen Lizhen Liang Qi w an Li Huimei(Cancer Institute,Sun Yat sen University of Medical Sciences,Guangzhou,510060)Abstract Objective:To investigate the expression of p53protein in nasopharyngeal carcinoma and its clinical sig nificant.Methods:Western blot hybridization and im munopercipitation techniques were used to examine protein expres sion of p53gene in human nasopharyngeal biopsy.Results:The104nasopharyngeal carcinoma biopsy12(11.5%) showed abnormal expression of p53protein.Abnormal expression of p53protein was not found in8biopsy of the na sopharyngeal chronic inflammation.The protein abnor mal of p53gene were11.8%(11/93)and9 1%(1/11)in na sopharyngeal carcinoma with EBV I gA/VCA 1 160and EBV IgA/VC A 1 80,respectively.The p53protein positive rates of mutation type were14 1%(11/78)and3 8%(1/26),respectively in nasopharyngeal carcinoma with EB V IgA/ EA positive and negative.2patients was found cancer rec urrence in12patients of p53protein abnormal e xpression. Conclussion:The study sho wed that the p53protein abnormal e xpression in patients was frequent in higher malignant de gree,later sta ge,higher IgA/VC A antibody titre and I gA/E A seropositive.It suggested that the p53gene might pay a certain role in nasopharyngeal carcinoma。
P53基因在鼻咽癌治疗中的研究进展
转录因子P53作为一种抑癌基因，可诱导细胞生长阻滞，细胞凋亡，细胞分化以及DNA 修复。
但P53 突变体可能会使野生型P53 基因的抑癌功能失活，甚至发挥癌基因的功能。
随着分子生物技术的发展，人们对P53基因结构及功能、与肿瘤发生的关系、肿瘤治疗尤其在鼻咽癌应用方面有很多新认识，因此就P53基因结构及功能、与肿瘤发生的关系、肿瘤治疗及在鼻咽癌应用方面的新进展进行综述。
标签：P53基因；肿瘤；鼻咽癌
鼻咽癌（NPC）是我国高发肿瘤之一，在头颈部恶性肿瘤中占首位。
据统计：我国南方某些地区NPC的发病率高达33/10万（男），15.60/10万（女）[4]。
鼻咽癌98%属低分化鳞癌，首选放射治疗，治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移[8]。
本文就近年来P53基因在鼻咽癌治疗中的研究进展做一综述，以利于更好的解决鼻咽癌这一临床顽症。
1 P53基因的结构及功能
P53基因（AB118156）系属肿瘤抑制基因家族，是与人类肿瘤相关性最高，也是当前研究的热点基因之一。
其位于染色体17p13.1，全长16～20 kb，含有11个外显子和10个内含子。
P53蛋白N-端为酸性区，C-端为碱性区[11]。
Toledo 等研究表明P53 基因蛋白还含有四聚体结构域，介导活化后P53 四聚体的形成[1]。
P53基因编码一种分子量为53000的磷酸化蛋白质，所以称为P53基因。
P53基因突变可增加正常细胞对突变剂的敏感性，结果导致正常细胞癌变概率增加，使肿瘤的发病率增加。
P53基因结构和功能改变与多种肿瘤的发生发展关系密切[4]。
P53基因分为突变型和野生型两类。
野生型P53是肿瘤抑制基因，可诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖。
突变型P53基因可抑制细胞凋亡，使肿瘤细胞增殖，对野生型P53基因有拮抗作用[11]。
2 P53与肿瘤发生
研究表明：绝大多数的肿瘤当中都发生了P53信号通路的失活，在所有恶性肿瘤中，P53 基因的突变率超过50%[10]，而且突变位点多位于DNA 结合区。
最新的研究发现某些突变形式的P53 蛋白能够在肿瘤细胞的核内积累，形成更稳定的四聚体。
研究发现，MDM2 作为P53 最主要的负调控因子，它的转录表达处于P53 的控制之下。
突变P53 不能有效激活MDM2 表达，使P53 失去了MDM2 的负调控，从而导致了突变P53在肿瘤细胞的核内积累[13]。
3 P53与肿瘤的治疗
3.1 P53凋亡刺激蛋白2（apoptosis stimulating protein 2 of P53，ASPP2）是P53结合蛋白家族促凋亡成员，ASPP2的C端和P53结合后增加P53引起的基因转录和促凋亡功能。
在人类肿瘤中，ASPP2表达常受抑制，小鼠动物模型显示，ASPP2等位基因具有明显的肿瘤抑制作用，说明ASPP2 具有抑制肿瘤发生的作用[9]。
3.2 P53基因突变是人类肿瘤中发现的最普遍的基因异常之一。
研究显示：人类50%以上的肿瘤与P53基因突变有着密切的关系[10]。
TP53 突变在肿瘤发生中是非常常见的，不同位点的点突变产生了多种形式的突变P53 蛋白[13]。
P53 突变和P53 失活都将使P53 失去肿瘤抑制功能，而且突变P53 还具有了获得性功能（GOF），对肿瘤发展有促进作用。
因此在肿瘤细胞中重新激活野生型P53 和使突变P53 恢复野生型P53功能将是未来肿瘤治疗中的一个重要方向[12]。
3.3 Teodoro等研究者提出，P53 可激发一个阻止肿瘤新血管生成酶的产生，通过增加该酶的表达或是用基因治疗输入该酶后，小鼠的肿瘤生长变慢[2]。
Teodoro 等还研究认为P53 基因阻止肿瘤血管生成机制至少有3种途径：①通过抑制缺氧诱导因子的形成；②通过抑制血管生成前因子的合成，如血管内皮生长因子、成纤维生长因子等；③通过增加内源性血管再生抑制因子的量或激活一些抑制血管再生的酶[3]。
研究表明：用腺病毒介导的P53基因治疗肺癌及其他肿瘤以增加P53表达，可明显抑制肿瘤血管生成，抑制肿瘤转移[14]。
4 P53与鼻咽癌治疗
4.1由于肿瘤位置深在、隐蔽，无法外科大块切除，因此放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方案[5]。
临床上常见同期别鼻咽癌患者采用相同的放射治疗技术、相同的放射治疗剂量，仍有20%～40%出现照射野内复发，其主要原因考虑与肿瘤内在放射敏感性相关[15]。
研究表明：Bcl-2、Ki-67、EGFR与鼻咽癌放射敏感性有一定相关性，可做为预测鼻咽癌放疗效果的重要指标，而P53则不能预测放疗敏感性[5]。
4.2中、晚期鼻咽癌复发率和转移率高、预后差，故应采用多种手段联合治疗的策略。
重组人P53腺病毒制品应用较多。
①腺病毒介导的人野生型P53基因能明显抑制鼻咽癌CNE细胞生长。
认为其可作为鼻咽癌治疗的一种选择方案[7]。
②D2-40是一种小分子勃液样跨膜糖蛋白，主要表达在淋巴管内皮上，而在血管内皮上不表达，广泛地用作淋巴内皮细胞和淋巴管生成的特異性标志物。
我们通过免疫组化检测发现rAd-P53瘤内注射后鼻咽癌原发灶组织中D2-40蛋白表达较治疗前明显增加，所以rAd-P53可能通过某种机制抑制鼻咽癌组织内淋巴管生成，从而抑制鼻咽癌的淋巴道转移途径[8]。
③导入肿瘤细胞内的rAd-P53基因与放化疗一样有诱导细胞凋亡的作用，而且与放化疗具有协同治疗作用，且rAd-P53瘤内注射联合同步放化疗治疗中晚期鼻咽癌患者可获得更好的肿瘤完全缓解率[17]。
④通过瘤体内注射rAd-P53可以提升瘤体内功能性P53的表达，并
且可以进一步导致瘤体内P21蛋白的表达，这也可能是其治疗鼻咽癌的作用机制之一[16]。
⑤rAd-P53瘤内注射后P53蛋白和P21WAF1蛋白阳性表达在抑制鼻咽癌复发和转移进程中起着重要作用。
P21WAF1蛋白的表达是影响鼻咽癌患者预后的危险因素，而P53蛋白可通过调节P21WAF1蛋白的表达间接影响患者的预后，两者对患者的预后判断有一定的指导意义[6]。
5结论
P53 基因在细胞周期中的重要作用已经成为人们关注的焦点，有着重要临床意义。
基因治疗是针对肿瘤发病机制的治疗手段，它为肿瘤治疗开拓光明前景。
P53 基因药物必将成为一种有效的肿瘤治疗手段并在肿瘤治疗中发挥重要作用。
而P53基因治疗在鼻咽癌中的应用已经应用于临床，但是剂量、时间等问题还需要我们继续研究。
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