位点专一性重组的核苷酸序列共54页文档
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位点专一性重组的名词解释位点专一性重组是一种基因工程技术,用于改变DNA的序列,以实现特定基因的修饰和定向转移。
它在生物医学和农业领域中具有重要的应用价值,并展示了巨大的潜力。
位点专一性重组的基本原理是利用特定酶切酶的特异性,将目标DNA片段切割成两段,并在切口处插入外源DNA片段,从而改变目标基因的序列。
这种重组技术可以用于基因敲除、基因修饰和基因添加等多种目的。
位点专一性重组最早是通过轮状病毒发现的,该病毒能够在RNA和DNA之间进行转录。
研究人员发现,轮状病毒在基因转移过程中会发生位点特异性的重组反应,从而启发了位点专一性重组技术的发展。
位点专一性重组技术的一个重要应用是基因敲除。
通过选择性地切割和修改目标基因的序列,可以引发基因沉默和功能丧失。
这为研究人员提供了一种方法,以研究基因功能和相关生物学过程的作用。
此外,位点专一性重组还可用于基因修饰,包括点突变、插入序列和基因互换。
这种技术允许研究人员针对特定基因进行精确的改变,以改变目标基因的表达模式或产生特定的表型。
位点专一性重组技术在农业领域也具有重要的应用。
通过修改农作物的基因序列,可以改善农作物的抗病性、耐逆性和产量。
这为农业生产提供了新的策略,以提高农作物的品质和产量,并减少对化学农药的依赖。
尽管位点专一性重组技术具有巨大的潜力,但其应用仍面临一些挑战和争议。
其中一个主要问题是技术的准确性和效率。
由于位点专一性重组是基于特定酶切酶的活性进行的,所以技术在特定位点的修饰和转移效率可能会有所差异。
此外,位点专一性重组的可能影响和风险也需要密切关注。
例如,基因转移过程中的不确定性可能导致意外的副作用和不可预测的结果。
因此,在使用位点专一性重组技术时,需要对其潜在风险进行全面的评估和管理。
总体而言,位点专一性重组技术在生物医学和农业领域中具有广泛的应用前景。
通过精确修改基因序列,可以为人们提供更多的治疗选择和农业生产的创新解决方案。
然而,随着技术的进一步发展和应用的扩大,我们也需要认识到其潜在风险,并采取适当的预防措施。
位点特异性重组我们可以看到,同源重组一般都在染色体内仍按DNA序列的原来排列次序。
但是在所谓位点特异性重组(site-specific recombination)中,DNA节段的相对位置发生了移动,从而得到不同的结果─DNA序列发生重排。
位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性(虽然亦可有很短的同源序列),而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存在。
这些特异的酶能催化DNA链的断裂和重新连接,它们能发动位点特异性重组作用.而在同源重组中,DNA链的切断完全是随机的,结果暴露出一些能与RecA这样的蛋白质相结合的顺序,从而发动交叉重组。
λ噬菌体DNA能通过重组作用整合进E.coli染色体的特异位点,成为前病毒(provirus,或称前噬菌体,prophage)。
λ的整合作用有两个特点:①这种交换是可逆的,原先存在的DNA顺序全部被保存下来,并无丢失;②噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的同源序列,重组交换必须通过其中的一个特定的核苷酸。
这两个特点也就是位点特异性重组的共同特点。
一、λ噬菌体的整合(integration)λ噬菌体编码λ整合酶(integrase)。
这个酶能指导噬菌体DNA插入E.coli染色体中。
这种插入作用是通过两个DNA分子的特异位点进行重组,将两个环状DNA分子变成一个大环。
在噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生,故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。
这种作用可用体外模型来进行实验。
用四种成份混合起来组成反应系统:纯的整合酶;来自 E.coli的一种辅助蛋白,称为整合作用宿主因子(IHF,integration host factor);镁离子;和含有噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点(称为attP和attB,att源自attachment)的DNA片段。
对于这个DNA片段,一个简单的制备方法就是人工构建含attP和attB两者质粒。
当整合反应发生时,即在attP和attB处发生交叉重组,产生两个较小的环状DNA。
同源重组遗传交换、染色体上基因重排、断裂DNA的修复(1)同源重组的形式⏹常发生在同源染色体之间(分子间重组)⏹也可发生在同一DNA分子内(分子内重组)(2)Holliday 模型解释同源重组的一个经典模型基于重组过程中有十字形的中间产物(3)RecBCD重组途径存于E. coli中,需要RecBCD蛋白(RecBCD protein,recB、recC、recD基因的产物)参与DNA损伤造成的双链断裂以及外源DNA线性分子的DNA断端。
RecBCD是一种具多功能的酶,依赖于DNA的ATPase(水解ATP, 为DNA的解螺旋提供能量);DNA helicase; DNA nuclease,可作用于单链或双链DNA, 切割χ位点(GCTGGTGG)χ(chi): crossover hotspot instigator RecBCD的切点与底物的序列有关,可在χ位点3’端4 ~ 6 ntRecA :38 kD 的蛋白质,具多种功能,在重组中促进同源DNA单链的交换(主要是一单链与一双链中的同源单链交换);交换过程需ATP。
RuvA和RuvB :RuvA和RuvB均具DNA helicase活性,RuvB还有ATPase活性;RuvA特异性识别并结合到Holliday junction,并促使RuvB蛋白结合到这一位点;RuvB水解ATP,提供能量,促使分支迁移RuvC :解开Holliday junction的核酸内切酶,特异地与Holliday junction结合,在特异位点切开Holliday junction。
RuvC是二聚体,有2个活性位点,能切开Holliday junction的两条链,切割位点有特异的序列,必须等branch migration 到达特异序列后,RuvC才能起作用,以何种方式解开Holliday junction取决于RuvC切割位点在两对同源单链上的频率。
(4)减数分裂重组(meiotic recombination)真核生物中常见的重组,与细菌中的重组有不少相似之处,但在起始的步骤有较大的差异,涉及DNA双链断裂(double-stranded DNA break,DSB)Spo11:核酸內切酶,能在染色体DNA上产生双链断裂而启动减数分裂重组;DNA切割必须发生在已复制的同源染色体开始配对的时候;DNA切割位点没有序列特异性,但是多分布在核小体包装疏松的染色体区域(如启动子区)(5)基因转换(gene conversion)多见于真核生物,当两相似的序列(等位基因、非等位基因均可)靠在一起时,就有可能发生基因转换,即一DNA序列转换成另一相似的序列,基因转换的机制是基于重组,即先交换一段DNA序列,再进行修复,就会使某一序列的比例增加。